2015最新免疫组化详细配方及步骤
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免疫组化液体配制
1.封闭液(0.3%H2O2溶液):
2. 洗涤液(0.1M磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2-7.4))现在洗液改用蒸馏水
3.柠檬酸抗原修复液(pH6.0)
A液
免疫组化步骤
1.石蜡切片常规脱蜡至水。
2.切片浸入0.3%H2O2封闭液置于摇床封闭15分钟,蒸馏水摇洗3min×3遍;
3.抗原修复:
A:高压修复(有时易掉片):加热修复液至沸腾后降功率至800瓦,将切片放入加盖,至喷气开始计时2分半后停止加热。置空气或水浴中缓慢冷却40分钟,温度降至室温左右时开锅洗涤,蒸馏水摇洗3min×3遍;
B:酶抗原修复,切片蜡笔划圈,滴加酶消化液50-100ul。37℃消化60分钟(掌握时间)后蒸馏水摇洗3min×3遍。
4.滴加稀释后的一抗50-100ul(依据组织大小计算),湿盒37℃1小时,或4度过夜。
5. 蒸馏水洗涤3min×3遍。;
6. 滴加二抗复合物,每张切片50-100ul,室温60分钟。
7. 蒸馏水摇洗3min×3遍,等待显色;
8. DAB配制:B液和C液按50:1混合配制后,加到玻片组织上显色,显微镜下观察至阳性结果出现而背景尚未着色时及时中止显色,蒸馏水反复冲洗(勿直接冲洗组织,防止脱片);
10.苏木素复染15min后冲洗,盐酸酒精分化至淡蓝色后冲洗,温水反蓝5min,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
注意:操作中的任何一个步骤不应出现切片表面干燥的现象,否则容易出现阴阳脸或者假阴性。