石蜡切片免疫组化步骤
1.脱蜡复水
二甲苯1（10min）二甲苯II （10min）二甲苯III （10min）无水乙醇I （10 min）无水乙醇II （5min）95％乙醇（5min）70％乙醇（3min）50％乙醇（3min）30％乙醇（3min）1X PBS浸泡（5min）。
2.抗原修复
a.将抗原修复液（250ml）加入开口容器中，放入微波炉中高火（9档）6min左右沸腾，
然后将玻片放入后，使用低火（3档）4min，微波炉中冷却5min，重复三次。（注意液面是否下降，如是需补充等温的缓冲液，或可放置一杯蒸馏水在微波炉中同时加热。）从微波炉中取出，室温等待缓冲液彻底冷却后（大约30-45 min），取出玻片。
TIP：修复液（柠檬酸：0.1g，柠檬酸钠：0.75g，溶于250mL去离子水）。
b. 用PBS洗（浸泡或冲洗）三次，每次5min。（期间用组画笔（疏水性油性蜡笔）圈出阻
止范围，以节省抗体）。
Tip：抗原决定簇在4％PFA固定过程中遭到破坏，因此需要复性过程以使抗原决定簇重新暴露出来，利于抗体结合。
3. 封闭
封闭液为5% 的二抗同源血清，配方为：[940 µl 1xPBS + 50 µl serum + 10 µl 10% BSA]
室温封闭1h，在湿盒中进行。结束后将载玻片竖立于吸水纸上，去除封闭液。不需要洗！Tip:从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景
Tip：如不使用二抗同源血清，也可使用3％~5％BSA进行封闭。
Tip：封闭作用：空间占位。BSA能非特异性的与表面抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会与非特异性的抗原结合，以降
低背景。
Tip：The secondary antibody may cross react with endogenous immunoglobulins in the tissue. Minimize this by pre-treating the tissue with normal serum from the species in which the secondary was raised.
Tip：The use of normal serum before the application of the primary also eliminates Fc receptor binding of both the primary and secondary antibody. BSA is included to reduce non-specific binding caused by hydrophobic interactions.
4.孵育一抗
一抗稀释液：dilution in 0.1% serum, 0.1% BSA in 1xPBS [989 µl 1xPBS + 1 µl serum + 10 µl 10% BSA]。
将稀释好的抗体滴加到蜡圈内的组织上，4℃过夜，在湿盒中进行。对照用同型IgG代替一抗。第二天取出后，室温恢复30-45min，结束后将载玻片竖立于吸水纸上，轻轻抖掉一抗，随后再甩几下，使用PBS在摇床上洗三次，每次10min。
Tip：Dilute the primary antibody to the manufacturer’s recommendations or to a previously optimized dilution. Most antibodies will be used in IHC-P at a concentration of 0.5–10 μg/mL.
5.去除内源性过氧化氢酶
玻片取出，放入3％的H2O2（PBS45ml+30％H2O2 5ml），室温孵育避光处理15min，消除内源性过氧化氢酶活性。PBS浸泡清洗三次，每次5min。
Tip：这里将去除内源性过氧化氢酶步骤放到孵育完一抗之后。使用PBS稀释。原因：Some epitopes are modified by peroxide, leading to reduced antibody-antigen binding. Incubate sections with peroxide after the primary incubation to avoid this problem. Peroxide can be diluted in TBS or water. Methanol is useful for blood smears or other peroxidase-rich tissues; peroxide diluted in methanol tends to reduce tissue damage caused by the reaction in aqueous solutions.For other tissue, dilute in TBS or water. Reduced binding of some antibody-antigen pairs, in particular cell surface proteins, has been observed after methanol/peroxide incubation. If using AP or fluorescent detection, omit peroxidase quenching as it only applies to HRP conjugates.
6.孵育二抗
dilution in 0.1% serum, 0.1% BSA in 1xPBS [989 µl 1xPBS + 1 µl serum + 10 µl 10% BSA]
避光操作。滴加一定稀释倍数HRP标记的二抗。室温孵育1-3h。使用PBS在摇床上洗三次，每次10min。
TIP：二步法信号增强剂。孵育增强液，30min，洗三次，3min/次，滴加孵育二抗，30min，洗三次，5min/次。
7. DAB 显色：DAB 显色需要在避光条件下进行，具体的显色时间根据抗体以及抗体浓度的不同需要调整，建议每隔30s 镜检一次。DAB 显色结果阳性应为特异性的棕黄色。显色完成，及时放入PBS中终止反应，防止显色过深。
8. 复染：复染的目的是为了使组织形态更加容易分辨且更美观，常用的复染试剂为苏木精，苏木精着色部位为细胞核。在显色完成后的片子上滴加苏木精染色1min-10min，将片子放入水中，上下刷几次。然后缓流自来水冲洗。（水洗的作用是洗去未与切片结合的染液）。光镜下观察着色，依据效果可以进行复染。随后自来水冲洗10-15min。
Tip：不同实验室所使用的苏木精着色能力不同，需要进行摸索。本实验室苏木精染色时间为9min。
9. 分色每张片子在酸乙醇（1％盐酸乙醇溶液）中上下涮 2 次，并立即转入 dH2O 中上下涮 2 次。将片子放于流动的自来水中冲洗2min以上。
10.蓝化
将片子放于1％的氨水中2min，随后转入dH2O中上下涮两次，将片子放于流动的自来水中冲洗2min。
11.脱水透明
30％乙醇3min，50％乙醇3min，70%酒精3min，85%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精Ⅰ 3min，100%酒精Ⅱ 3min，二甲苯Ⅰ 3min，二甲苯Ⅱ 5min。
11.封片
