草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

２０１１年２月　

第３Ｏ卷第１期　重庆文理学院学报（自然科学版）　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｒｔｓ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｆｅｂ．．２０ｌ１　

Ｖ０１．３０　Ｎｏ．１　

草鱼肌肉生长抑制素ｃＤＮＡ克隆及序列分析　

孙翰昌　，黄　利　，丁诗华　

（１．重庆文理学院生命科学与技术学院，重庆永川４０２１６８；　

２．西南大学动物科技学院水产系，水产科学重庆市重点实验室，重庆北碚４００７１６）　

［摘　要］利用ＲＴ—ＰＣＲ技术，从草鱼肌肉组织中克隆出ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ序列，长度为ｌ　７６４　ｂｐ，　

编码区为１　１２８　ｂｐ，共编码３７５个氨基酸．前体蛋白包括信号肽序列、Ｎ端前肽区、蛋白酶水解　

位点ＲＩＲＲ及ｃ端活性区（含９个保守的Ｃｙｓ残基）．多重序列比较表明，草鱼与斑马鱼、黑头　

软口鲦之间的ＭＳＴＮ序列同源性在９４％以上，与其它鱼类之间的序列同源性也较高（７８．１％　

一８２．３％），但与鸟类、哺乳类之间的序列同源性则相对较低．系统进化分析显示，不同物种间　

的ＭＳＴＮ序列同源性基本反映了它们的亲缘关系．　

［关键词］草鱼；肌肉生长抑制素；克隆；序列分析　

［中图分类号］￥９１７．４［文献标志码］Ａ［文章编号］１６７３—８０１２（２０１１）０１—００５０—０５　

肌肉生长抑制素是转化生长因子一Ｂ（ｔｒａｎｓ—　

ｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ—ｐ，ＴＧＦ—ｐ）超家族的一　

员，具有ＴＧＦ—Ｂ共有的结构特征，如存在Ｎ端　

前肽区、蛋白酶水解位点及Ｃ端活性区（含有多　

个保守的Ｃｙｓ残基），但又与ＴＧＦ一８超家族其　

它成员的同源性很低，故又称为ＧＤＦ一８（ｇｒｏｗｔｈ　

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ一８）　，其功能是抑制肌肉细　

胞的增殖和分化．在小鼠实验模型中发现，ＭＳＴＮ　

基因敲除后可促进肌细胞增殖，导致骨骼肌重量　

可达正常鼠的２～３倍　Ｊ．当小鼠注射ＭＳＴＮ抗　

体后，骨骼肌重量和力量亦明显增加　』．此外，　

ＭＳＴＮ基因突变可能引起ＭＳＴＮ表达异常或活性　

降低，导致骨骼肌过度生长，如世界闻名的２个　

双肌牛品种即比利时蓝牛（Ｂｅｌｇｉａｎ　Ｂｌｕｅ）和皮德　

蒙特牛（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ）就是由于ＭＳＴＮ基因突变　

后不能产生有活性的ＭＳＴＮ，从而出现“双肌”表　

型特征　ｊ．ＭＳＴＮ是肌肉生长的负调控因子，可　

影响养殖动物的产肉量，近年来已受到动物遗传　

育种研究者的重视．　

迄今已有很多脊椎动物的ＭＳＴＮ基因或ｃＤ—　

ＮＡ序列被克隆，相关的研究报道主要集中在哺　

乳类、鸟类及鱼类的ＭＳＴＮｌ８　Ｊ．鱼类中已报道了　

５０　斑马鱼（Ｄａｎｉｏ　ｒｅｒｉｏ）、金头鲷（Ｓｐａｒ￣ａｕｒａｔａ）、溪　

红点鲑（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ　ｆｏｎｔｉｎａｌｉｓ）、黑头软口鲦　

（Ｐｉｍｅｐｈａｌｅｓ　ｐｒｏｍｅｌａｓ）等十多种鱼的ＭＳＴＮ基因　

或ｃＤＮＡ序列　，但尚无有关草鱼ＭＳＴＮ的分子　

克隆和序列分析的研究报道．鱼类ＭＳＴＮ的分子　

克隆可为进一步研究ＭＳＴＮ在鱼类肌肉生长、分　

化中的作用机理奠定基础，还可为鱼类遗传育种　

方面的应用研究创造条件．利用基因工程技术敲　

除鱼类ＭＳＴＮ基因，或利用免疫技术诱导鱼体产　

生ＭＳＴＮ抗体，可消除ＭＳＴＮ对鱼类肌肉生长的　

抑制作用，为养殖鱼类产肉量的提高提供一种新　

的途径．因此，进行鱼类ＭＳＴＮ的分子克隆具有　

较大的理论意义和应用价值．本研究选择我国重　

要的养殖品种草鱼为研究对象，根据已报道的鱼　

类ＭＳＴＮ序列ｌ】　”ｊ，利用ＲＴ—ＰＣＲ技术克隆出　

草鱼ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ并进行序列分析．　

１材料与方法　

１．１实验动物、菌株　

实验草鱼（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ　ｉｄｅｌｌｕｓ）购自重　

庆北碚区天生桥市场，体质健康，体长３０　ｃｍ，平　

均体重（６００－４－５０）ｇ．大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　

［收稿日期］２０１０—１０—１９　

［基金项目］重庆市教委科技项目（ＫＪ０９１２１５）；重庆文理学院科研项目（Ｙ２００９ＳＫ６８）．　

［作者简介］孙翰昌（１９７８一），男，

海南儋州人，讲师，硕士，主要从事水产生物技术研究　ＤＨ５ｅｔ由本实验室保存．　

１．２主要试剂　

Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、琼脂糖、ｄＮＴＰ、核酸分子　

量标准ＤＬ２０００、ＤＮＡ回收试剂盒、ｐＭＤ１８一Ｔ载　

体购自大连ＴａＫａＲａ生物工程有限公司．Ｔｒｉｚｏｌ、　ＤＥＰＣ及Ｍ—ＭＬＶ第一链ｃＤＮＡ合成试剂盒购　

自上海生工生物工程公司．用于草鱼ＭＳＴＮ　ｃＤ—　

ＮＡ扩增的３对引物是根据鱼类ＭＳＴＮ的保守序　

列设计（表１），由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成．　

表１扩增ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ的３对引物　

上游引物　下游引物　

ｆｌ：ＣＴＡＣＣ，ＩＴ】　ＡＧＣＡＣＧＡＴＴＧＧ　

ｔ２：ＧＡＡＡＣＣＧＡＡ　

ｆ３：ＣＴＧ＇ＩＴＣＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＡＣＴＡＣ　ｓｌ：ＴＡＴＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＧ　

ｓ２：ＴＧＴｒＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＣ＇ＩＴＧＧＴＧ　

ｓ３：ＣＣＴｒＣＴＧＴＣＣＣＣＣ　ｒｒＡＧＧＣＧＡＴ　

１．３总ＲＮＡ的提取和第一链ｃＤＮＡ的合成　

取５０～１００　ｍｇ背部肌肉按照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒　

说明书抽提总ＲＮＡ，置于一８０　ｃＣ冰箱保存．逆转　

录反应按照Ｍ—ＭＬＶ第一链ｅＤＮＡ合成试剂盒　

说明书进行，以适量总ＲＮＡ为模板，以Ｏｌｉｇｏ　

（ｄＴ）为引物，逆转录反应体系于３７℃温育１ｈ，　

７０℃温育１０　ｍｉｎ．　

１．４逆转录产物的ＰＣＲ扩增　

以第一链ｅＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增．　

ＰＣＲ反应体系（２５　Ｌ）为：１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５　

Ｌ，ＭｇＣ１２（２５　ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５　ＩｘＬ，ｄＮＴＰ（各种浓度　

为２．５　ｍｍｏＶＬ）１　Ｌ，引物（１０　ｍｍｏｌ／，Ｌ）各１　

Ｌ，Ｅｘ　Ｔａｑ　０．２　Ｌ，ｃＤＮＡ　１　ｔｘＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１６．８　ＩｘＬ．　

以引物ｎ、ｓｌ扩增ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ的３　端序列，ＰＣＲ　

反应程序为：９４℃预变性３　ｒａｉｎ；９４℃５０　ｓ，　

５４℃４５‘Ｓ，７２　ｏＣ　１　ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸　

１０　ｍｉｎ．扩增ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ的中间片段序列时采　

用ｆ２、ｓ２引物，反应条件为：９４℃预变性３　ｒａｉｎ；　

９４　ｃＩ＝５０　Ｓ，５２℃４５ｓ，７２。【＝１　ｍｉｎ，３５个循环；７２　

℃延伸１０　ｍｉｎ．引物ｆ３、ｓ３用于扩增ＭＳＴＮ　ｅＤＮＡ　

的５　端序列，反应程序为：９４℃预变性３　ｍｉｎ；９４　

℃５０　ｓ，５７　４５　Ｓ，７２　１　ｍｉｎ，３５个循环；７２　ｃＣ　

延伸１０　ｍｉｎ．ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳检　

测，凝胶成像分析系统（Ｂｉｏ—Ｒａｄ产品）记录检　

测结果．　

１．５　ＰＣＲ产物的克隆和序列测定　

ＰＣＲ产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳纯化，按　

ＤＮＡ回收试剂盒说明书，从琼脂糖凝胶中回收　

目的ＤＮＡ片段．按Ｔ４连接反应试剂盒（ＴａＫａＲａ　

产品）说明书将目的ＤＮＡ片段与ｐＭＤ　１８一Ｔ载　

体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ．将适量转化菌液　

涂在含氨苄青霉素的ＬＢ平板上，３７℃培养过　夜．随机挑取白色菌落，用ＰＣＲ法检测出阳性克　

隆，送交Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ上海公司测序．测序结果用　

ＤＮＡｓｔａｒ、ＤＮＡｍａｎ软件分析，并与ＧｅｎＢａｎｋ中的　

同源序列进行ＢＬＡＳＴ比对．　

２结果与分析　

２．１　总ＲＮＡ的提取和ＲＴ—ＰＣＲ扩增　

草鱼肌肉总ＲＮＡ经１％琼脂糖凝胶电泳检　

测，显示３条清晰的条带，提示有较好的完整性．　

其Ａ２６０／Ａ２８０值在１．８—２．０之间，说明总ＲＮＡ　

纯度较高．经反转录后，用引物ｆ１和ｓ１扩增，获　

得一条特异性扩增条带，测序结果表明该条带代　

表草鱼ＭＳＴＮ　ｅＤＮＡ的３　端序列，长度为５４６　ｂｐ．　

引物ｆ２和ｓ２则扩增出一条长度为６４７　ｂｐ的特　

异性条带，为草鱼ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ的中间片段序列．　

反转录产物经引物｛３和ｓ３扩增后，同样获得一　

条预期的特异性条带，长度８１７　ｂｐ，为草鱼ＭＳＴＮ　

ｅＤＮＡ的５　端序列。　

２．２草鱼ＭＳＴＮ　ｅＤＮＡ的序列分析　

３条特异性扩增片段经测序后拼接，获得了　

１　７６４　ｂｐ的ｃＤＮＡ序列．ＢＬＡＳＴ检索同源序列显　

示，该序列与鱼类等脊椎动物ＭＳＴＮ　ｅＤＮＡ有较高　

的同源性，属草鱼ＭＳＴＮ　ｃＤＮＡ．序列数据已提交　

ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＥＵ５５５５２０．该ｃＤＮＡ序列的５　

非编码区为２４　ｂｐ，３　非编码区为６６３　ｂｐ，编码区位　

于２５～１　１５２　ｂｐ，长１　１２８　ｂｐ，编码３７５个氨基酸残　

基构成的前体蛋白，其中包括２２个氨基酸残基构　

成的信号肽，信号肽切割位点在Ｇｌｙ２２和Ａｓｐ２３　

之间（图１）．前体蛋白序列中有一个蛋白酶水解　

位点ＲＩＲＲ，位于第２６３—２６６位氨基酸．该位点与　

信号肽序列之间的肽段为前肽区．蛋白酶水解位　

点之后的Ｃ端肽段区域则为Ｃ端活性区，含有９　

５１

　个保守的Ｃｙｓ残基，分别位于第２７２、２８１、２８２、　

３０９、３１３、３３９、３４０、３７２、３７４氨基酸位点．　

ＴｃｃＴＴ丌Ａｏｃ＾ｃＧｃ。丌ＧＧＡＡｃ　。　Ａ　。　。Ｖ丌＾Ａ『『　４９　Ｔｃ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＡＴＴ（　Ａ　ＴＧＴ　ＯＧＴ　ＣＣＡ丽０娼　ＡＡＴ—酮　ＧＡＴ　

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图ｌ　草鱼ＭＳＴＮ的核苷酸序列及推断氨基酸序列　

（注：氨基酸序列位于核苷酸序列之下；起始密码　

子、终止密码子用粗体字母表示；信号肽用下划线表示；　

酶切位点用方框表示；ｃｖｓ残基用阴影表示．）　

２．３　不同动物ＭＳＴＮ的同源性比较　

从ＧｅｎｅＢａｎｋ中搜索已知ＭＳＴＮ序列，与本　

研究得到的草鱼ＭＳＴＮ序列进行同源性比较，结　

果见表２．草鱼ＭＳＴＮ与黑头软口鲦ＭＳＴＮ之间　

的同源性最高，核苷酸序列同源性为９７．６％，氨　

基酸序列同源性为９７．９％；与多耙牙鲆（Ｐｎｒ０缸　

ｃ＾　０　ｐｅ　）、金头鲷、黑鲷、溪红点鲑、斑马　

鱼ＭＳＴＮ的核苷酸序列同源性为７３．４％～　

９５．３％，氨基酸序列同源性为７８．１％～９４．４％；　与鸟类、哺乳类ＭｓＴＮ相比，无论核苷酸序列同　

源性还是氨基酸序列同源性均相对较低．　

２．４不同动物ＭＳＴＮ的系统发育树分析　

根据本研究得到的草鱼ＭｓＴＮ序列和蛋白　

质数据库中其它动物的完整ＭＳＴＮ序列，利用　

ＤＮＡｓｔａｒ生物学软件（ＮＪ法）构建了包括草鱼在　

内的ｌ７种动物ＭＳＴＮ的系统进化树（如图２），　

树上各分支处的数字代表１　０００次Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ检　

验后对该分支的置信度．系统进化树共有２个大　

分支，一个由鸟类、哺乳类构成，另一个为鱼类．　

在鱼类构成的大分支中，草鱼ＭＳＴＮ与同为鲤科　

鱼类的黑头软口鲦、斑马鱼ＭＳＴＮ组成一个紧密　

的亚群，而黑鲷、金头鲷、多耙牙鲆、溪红点鲑　

ＭＳＴＮ构成另一个亚群．　

图２基于草鱼与其它物种ＭｓＴＮ氨基酸序列的系统发育树　

（草鱼　ｅ，　ｇ０如ｎ　如ｚ地，黑头软口鲦　一　

ｐｒ０，ｎｅＺ∞，斑马鱼Ｄｎｎ　ｒｅｒ　ｏ，溪红点鲑Ｓ口　Ｚ　ｎ　ｎ．　

，黑鲷　ｃｎｍ　ｇ７１　ｓｃ　啦　，多耙牙鲆ｆ　ｒⅡ　＾　

，金头鲷却鲫　。删。，人　加５叩　叭ｓ，狒狒ｐ印一　

Ｄ　袱岫，牛舶ｓ　０“九格，牦牛勘ｓ　ｇｒ¨ｎ　ｅ瑚，鸡　ＺＺ　

，火鸡　ｆｅ　ｇⅡｆｆｏｐ伽，猪Ｊｓ　ｓｃ咖，羊　。　，　

草兔　ｅｐ　ｃ叩ｅｍ　ｓ　，负鼠＾ｆ０∞如ｆｐ觚如ｍ　￡　口）　

表２草鱼与其它动物ＭｓＴＮ的同源性比较　

５２