淀粉酶活性测定实验报告

班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223

淀粉酶活性的测定

一、研究背景及目的

酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。

α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内

二、实验原理

萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。

酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。

在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。

三、材料、试剂与仪器

实验材料：

萌发的小麦种子（芽长1厘米左右）

仪器：

722光栅分光光度计(编号990695)

DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056)

离心机(TDL-40B)

容量瓶：50ml×1，100ml×1

小台秤

研钵

具塞刻度试管：15ml×6

试管：8支

移液器

烧杯

试剂：

①1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）；

②pH5.6的柠檬缓冲液：

A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）

B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）

取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；

③3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）；

④麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；

⑤0.4M NaOH

四、实验步骤

1. 酶液的制备

称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆，转移到50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，混匀后在室温下放置，每隔数分钟振荡一次，提取15-20分钟，于3500转/分离心20分钟，取上清液备用。

2.α-淀粉酶活性的测定

①取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管

②于每管中各加酶提取液液1ml，在70℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±

0.5℃）准确加热15min，在此期间β-淀粉酶钝化，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。

③在试管中各加入1ml柠檬酸缓冲液

④向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，以钝化酶的活性

⑤将测定管和对照管置于40℃（±0.5℃）恒温水浴中准确保温15min再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH,以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。

3. 两种淀粉酶总活性的测定

取上述酶液5ml 于100ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（稀释倍数视样品酶活性大小而定，一般为20倍）。混合均匀后，取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管，各管加入1ml 稀释后的酶液及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml ，以下步骤重复α-淀粉酶测定的第④及第⑤的操作。

4. 麦芽糖的测定 ⑴标准曲线的制作

取15ml 具塞试管7支，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，用蒸馏水补充至1.0ml ，摇匀后再加入3，5-二硝基水杨酸1ml ，摇匀，沸水浴中准确保温5min ，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml ，摇匀后用分光光度计于520nm 波长下比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 ⑵样品的测定

取15ml 具塞试管8支，编号，分别加入步骤2和3中各管的溶液各1ml ，再加入3，5-二硝基水杨酸1ml ，摇匀，沸水浴中准确煮沸5min ，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml ，摇匀后用分光光度计于520nm 波长下比色，记录消光值，根据标准曲线进行结果计算。

五、数据整理及计算

上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），计算上表中第4行数据（各样品的OD 值）均值，填入上第5行中，根据标准曲线的方程，计算第5行OD 值所对应的麦芽糖浓度，填入最后一行，如上表。

根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：

11··g 5

α--⨯-=

⨯（A －A'）样品稀释总体积

淀粉酶活性（毫克麦芽糖克鲜重分钟）样品重（）

11()?·g 5

αβ--⨯-+-=⨯（B －B'）样品稀释总体积

淀粉酶活性（毫克麦芽糖克鲜重分钟）样品重（）

A ——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度

A ’——α-淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度

B ——(α-+β-)淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B ’——(α-+β-)淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 计算结果如下：

α-淀粉酶活性= （毫克麦芽糖•克-1鲜重•分钟-1）