基因组DNA的提取与分离鉴定
课后研讨题
1、动植物DNA提取的方法主要有哪些？并说明各方法的原理。
答：
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.
（2）.阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以
常用阴离子去污剂提取DNA.
（3）.苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .
（ 4）.水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
2、苯酚、氯仿和异戊醇在基因组DNA的提取中各有什么作用？
答：苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
氯仿：氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚，苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
3、无水乙醇沉淀DNA的原理是什么？
答：用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA 失水而易于聚合。
4、结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？答：(1)控制好温度，保持温度在适宜范围内，因为短时高温主要是造成DNA的变性，也就是DNA双链解链成为单链，但在温度下降后会恢复为双链形式。DNA在溶液尤其是水的稀溶液中，会发生自然的降解作用。降解作用速率和温度关系不大，但是反复的冻融会加速DNA 的断裂和降解。
（2)操作过程必须全程温和进行，若剧烈震荡，转移DNA的抢头没有剪去尖部，扩宽管口，吸取过程产生汽泡，用了反复吸打的的方法助溶DNA沉淀都可能导致DNA断裂。。
（3）为防止DNase的降解作用，器具尽可能灭菌，加EDTA。PH最好是在8.0
5、DNA含量的测定方法有哪些？并说明各方法的原理。
6、如何判断所提取样品DNA（RNA）的纯度？
7、总结DNA琼脂糖凝胶电泳实验操作的关键环节和注意事项。
8、DNA琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。
9、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发展。
10、查阅资料，说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途？
