最新WB过程中常见问题及处理方法
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5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数，增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
• 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二
抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。 可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性
• 更换更好的一抗二抗
2、一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度； 长孵育时间；
Baidu Nhomakorabea
3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应
• 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20 • 更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或
明胶）
4、样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过
• 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没
有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。 后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样 本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目
2、制胶 根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净， 不能有残留的胶。 玻璃板底部放平，尽量不能漏胶 灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝 水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜
a 泡膜：
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶 皱缩，导致出现转移条带变形
WB过程中常见问题及处理方法
WB的简介
• WB 即蛋白质印迹法（Western Blot）。它
是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中 常用的一种实验方法。
基本原理 通过特异性抗体对凝胶电泳处理
过的细胞或生物组织样品进行着色，分析 着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数； 3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应
——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化
c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三 滤+海绵+阳极碳板，不能放反
d转膜过程产生大量的热，注意冷却
e具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定； 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间 越长，反之则短
f避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手 上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜 脏掉。
3、封闭 封闭液的选择； 封闭条件优化 ；
……
4、漂洗 漂洗液的配制与选择 漂洗时间及次数
5、抗体孵育 抗体及稀释液选择； 抗体稀释倍数优化 ； 抗体孵育时间； ……
6、曝光 曝光时间的掌控
四、注意事项
• 1.蛋白样品的提取
尽可能新鲜组织或蛋白 避免反复冻融 对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF） 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶 或采取不同提取策略） 选择合适的裂解液 准确定量（BSA标准蛋白）
电泳中的问题 ︶条带呈笑脸状 ——凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;
——电泳系统温度偏高
• ︵ 条带呈皱眉状
可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃 挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全
拖尾 样品溶解不好
• 纹理（纵向条纹）
样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
g夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之 间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全
h保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大 和过小都会影响转膜效率
i一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则 极易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记
的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生 物素
38
• b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体
分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜 上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化
• c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉
作为封闭剂
5、孵育
• a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降
低背景；
• b注意一抗二抗的匹配
• c一抗二抗的效价问题
五、常见问题及解决
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均
• 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合
• 过滤封闭剂
结束语
谢谢大家聆听！！！
应用 1.目的蛋白的表达特性分析 2.目的蛋白与其它蛋白的互作 3.目的蛋白的组织定位 4.目的蛋白的表达量分析
三、WB的影响因素
步骤较多，任何一步都可能影响结果 1、电泳分离蛋白
蛋白抽提； 蛋白定量； 样品制备变性； 上样量； 电泳（电压、电流的大小，胶浓度、制胶）
2、转膜 膜的选择； 膜的确认； 特殊处理 ； ……
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
• 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二
抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。 可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性
• 更换更好的一抗二抗
2、一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度； 长孵育时间；
Baidu Nhomakorabea
3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应
• 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20 • 更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或
明胶）
4、样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过
• 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没
有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。 后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样 本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目
2、制胶 根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净， 不能有残留的胶。 玻璃板底部放平，尽量不能漏胶 灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝 水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜
a 泡膜：
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶 皱缩，导致出现转移条带变形
WB过程中常见问题及处理方法
WB的简介
• WB 即蛋白质印迹法（Western Blot）。它
是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中 常用的一种实验方法。
基本原理 通过特异性抗体对凝胶电泳处理
过的细胞或生物组织样品进行着色，分析 着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数； 3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应
——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化
c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三 滤+海绵+阳极碳板，不能放反
d转膜过程产生大量的热，注意冷却
e具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定； 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间 越长，反之则短
f避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手 上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜 脏掉。
3、封闭 封闭液的选择； 封闭条件优化 ；
……
4、漂洗 漂洗液的配制与选择 漂洗时间及次数
5、抗体孵育 抗体及稀释液选择； 抗体稀释倍数优化 ； 抗体孵育时间； ……
6、曝光 曝光时间的掌控
四、注意事项
• 1.蛋白样品的提取
尽可能新鲜组织或蛋白 避免反复冻融 对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF） 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶 或采取不同提取策略） 选择合适的裂解液 准确定量（BSA标准蛋白）
电泳中的问题 ︶条带呈笑脸状 ——凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;
——电泳系统温度偏高
• ︵ 条带呈皱眉状
可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃 挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全
拖尾 样品溶解不好
• 纹理（纵向条纹）
样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
g夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之 间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全
h保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大 和过小都会影响转膜效率
i一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则 极易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记
的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生 物素
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• b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体
分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜 上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化
• c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉
作为封闭剂
5、孵育
• a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降
低背景；
• b注意一抗二抗的匹配
• c一抗二抗的效价问题
五、常见问题及解决
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均
• 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合
• 过滤封闭剂
结束语
谢谢大家聆听！！！
应用 1.目的蛋白的表达特性分析 2.目的蛋白与其它蛋白的互作 3.目的蛋白的组织定位 4.目的蛋白的表达量分析
三、WB的影响因素
步骤较多，任何一步都可能影响结果 1、电泳分离蛋白
蛋白抽提； 蛋白定量； 样品制备变性； 上样量； 电泳（电压、电流的大小，胶浓度、制胶）
2、转膜 膜的选择； 膜的确认； 特殊处理 ； ……