葡聚糖酶酶活测定

β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法：UPLC-MS-4216：50T/24S试剂名称规格保存条件提取液液体50mL×1瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2支2-8℃保存试剂二液体42mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1.试剂一：临用前取1支加1.6mL蒸馏水溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；2.标准品：10mg无水葡萄糖。

临用前加入1mL蒸馏水溶解，配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存2周。

β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。

在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。

β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。

Fucoidanβ-1,3-GA Reducing SugarReducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200w超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

β-葡聚糖酶活性‎测定β-葡聚糖是由葡‎萄糖单体通过‎β-1，3和β-1，4糖苷键连接‎而成的D型葡‎萄糖聚合物，它主要存在于‎单子叶禾本科‎谷实中的糊粉‎层和胚乳细胞‎壁中。

β-葡聚糖酶属于‎水解酶类，能有效地降解‎β-葡聚糖分子中‎的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小‎分子。

由于在饲料中‎，大麦的β-葡聚糖含量较‎高，难以被单胃动‎物消化利用，而且对饲料中‎各种养分的消‎化利用具有明‎显的干扰和抑‎制作用，成为麦类饲料‎中的抗营养因‎子。

在饲料中添加‎β-葡聚糖酶，能有效地消除‎β-葡聚糖的抗营‎养作用，促进饲料中各‎种养分的消化‎和吸收利用，增进畜禽健康‎。

在啤酒生产中‎，添加β-葡聚糖酶可以‎加快麦汁和啤‎酒的过滤速度‎、提高麦汁得率‎、增加可发酵糖‎的含量。

此外，β-葡聚糖酶在造‎纸工业、日化工业等其‎它许多方面也‎有着广泛的应‎用，对β-葡聚糖酶的研‎究将越来越受‎到人们的重视‎。

β-葡聚糖酶活力‎的测定方法主‎要有3种：还原糖测定法‎（分光光度法）、粘度测定法和‎底物染色法。

其中还原糖测‎定法简便实用‎，比较准确，而且结果重复‎性好，是广泛使用的‎一种酶活测定‎方法。

其原理是：β-葡聚糖酶能将‎β-葡聚糖降解成‎寡糖和单糖，其具有的还原‎基团在沸水浴‎条件下可与D‎NS试剂发生‎显色反应，显色的深浅与‎还原糖量成正‎比，而还原糖的生‎成量又与反应‎液中β-葡聚糖酶的活‎力成正比，因此，可以利用比色‎测定反应液的‎吸光度值来计‎算还原糖的生‎成量，从而得出β-葡聚糖酶的活‎力。

但在该测定方‎法的具体操作‎中存在一些影‎响酶活力测定‎结果的因素，本文即对还原‎糖法测定β-葡聚糖酶活力‎的几个重要影‎响因素进行研‎究，并得出最佳测‎定条件。

1 材料与方法1.1 菌株与培养基‎1.1.1 发酵产酶菌株‎黑曲霉（Asperg‎illus niger）A47菌株，由本实验室保‎藏。

1.1.2 固态发酵培养‎基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3‎ 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100‎ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。

蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。

纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。

2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。

3.试剂和溶液3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。

取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。

3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。

5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。

各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。

冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。

以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(4):708~712*基金项目： 国家自然科学基金 （No.20276064） 资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事食品微生物相关的研究。

E­mail:<gqhe@>. 收稿日期：2006­12­25 接受日期： 2007­03­16 ·研究论文· 基因工程菌 产 茁 ­葡聚糖酶条件优化及产酶特性 *李青青 1 , 陈启和 1 , 蒋孝燕 1, 张秀艳 2 , 李 婷 1 , 何国庆 1 ** (1.浙江大学食品科学与营养系， 杭州 310029； 2.华中农业大学食品安全与微生物学系， 武汉 430070)摘要： 用乳清粉作为主要培养基组成， 采用正交试验对大肠杆菌 （ ） 重组菌 的发酵条件进行了优化，并 对粗酶液的酶学性质进行了研究。

重组菌 的最佳发酵条件为： 摇床转速 170r/min ， 接种量 1%， 发酵培养基初始 pH 6.0，种龄12h 。

重组菌茁 ­葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关， 发酵 14h 后， 菌体生物量最高可达1.71g/L ， 茁 ­ 葡聚糖酶活力最高可达 321.56U/mL 。

所得粗酶液的最适反应温度 60 ℃,pH 6.0， 在 70 ℃以下保温20min 后， 残余酶活力均在 80%以上。

在pH 5.0～9.0放置48h 后仍能保持均90%以上的残余酶活力。

关键词： 茁 ­葡聚糖酶；重组菌 EGs2； 发酵条件； 酶学性质 中图分类号: S182 文献标识码:A 文章编号:1006­1304(2007)04­0708­05Optimization of Recombinant Fermentation ConditionAffecting 茁­glucanase Production and Its Characteristics of Enzyme LI Qing­qing 1 ,CHEN Qi­he 1 ,JIANG Xiao­yan 1 ,ZHANG Xiu­yan 2 ,LI Ting 1 ,HE Guo­qing 1**The fermentation conditions of mutant obtained from directed evolution for thermostable 茁­glucanase for 茁­glucanase production were investigated by orthogonal experiment.Fermentation was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium contained whey 10g/L,yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,the temperature was 37 ℃.The optima culture conditions were as following:initial pH 6.0,shaking speed 170r/min,inoculation volume 1%and inoculation time 12h. 茁 ­glucanase production by mutantwas associated with cell growth and biomass. 茁­glucanase activity was increased significantly when cells entered growth phase.The bacterium began the stable phase after cultured for 14h with the highest biomass 1.71g/L and 茁­glucanase activity 321.56U/mL.When 茁 ­glucanase was used as a substrate,the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6.0,respectively. After 20min incubation at 40,50,55,60,65and 70 ℃ respectively,the residual activity remained at least 80%.After 48h conserva­ tion at pH 5.0~9.0,the residual activity remained at least 90%.The enzyme was stable below 70 ℃ and at pH 5.0~9.0.茁­glucanase;mutant ;fermentation condition;enzyme characteristic茁­1,3­1,4­ 葡聚糖酶是重要的工业用酶。

β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。

还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。

反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。

因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。

∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。

用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。

2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。

2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。

电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。

然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。

以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。

以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。

每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。

吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。

∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。

然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。

跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。

实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。

分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。

在微生物中主存于需氧菌。

SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。

二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

SOD作为治因而受到医药界的关注。

目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。

酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。

在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。

通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。

色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。

该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。

粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。

木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。

基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。

这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。

免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。

用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。

在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。

比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。

*基金项目：浙江省科技计划项目(No.011101123)。

郑元平：男，1972年生，博士研究生。

**通讯作者。

Author for correspondence.Email:<yuankp@>.收稿日期：2003-04-28接收日期：2003-08-27。

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):316~321·研究论文·啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化*郑元平袁康培**冯明光(浙江大学微生物研究所，杭州310029)摘要：对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌()A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育，获得产β-葡聚糖酶达27.3U/mL 的突变株遥采用均匀实验设计对菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验，所获优化配方(W/V)为麦麸1.41%，鱼粉0.80%，硝酸钾0.34%，硫酸镁0.11%，起始pH 6.0；用含孢量108个/mL 的种子菌液按体积比3.3%接种上述液体培养基，在36℃下发酵52h ，菌株的产酶活力达到115.1U/mL ，是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9.4倍。

对突变株所产β-葡聚糖酶性质的研究表明，该酶最适作用温度为60℃，最适作用pH 为5.5，适用于啤酒生产中的麦芽糖化。

关键词：β-葡聚糖酶；菌种选育；物理化学诱变；均匀设计；发酵Breeding of a Bacterial Strain for Efficient Production of Beer-purposeβ-glucanase and the Optimized Conditions for Its FermentationZHENG Yuan-Ping YUAN Kang-Pei**FENG Ming-Guang(Institute of Microbiology,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China)A mutantwas generated from mutagenesis ofstrain A302by inducing ultraviolet radiationand treating with 1%diethyl sulfate solution and could produce β-glucanase at the level of 27.3U/mL.Based on uniformexperimental design and data analysis,components of an ideal liquid medium (W/V)for maximal production ofβ-glucanaseincluded 1.41%wheat bran,0.80%fish meal,0.34%potassium nitrate and 0.11%magnesium sulfate.The optimal conditions for fermentation were determined at 36℃,initial pH of 6.0and seed culture of 2%(V/V)containing 108spores/mL.Based on the optimized medium and conditions for fermentation,a 52h period of incubation allowed the mutant to produce the β-glucanaseat an activity level of 115.1U/mL,which was as high as 9.4folds of the level for the original strain A302.The enzyme functionedoptimally at pH 5.5and 60℃,which indicated that it was fit for beerproduction.β-glucanase;breeding of bacterial strains;physiochemical mutagens;uniform experimental design;fermentationβ-葡聚糖是一种非淀粉性多糖，广泛存在于植物和微生物的细胞壁中，不同来源的β-葡聚糖其糖苷键的结合方式和比例不同。