腺病毒滴度测定

试验室犬的犬腺病毒2型感染疾病的诊疗防治犬腺病毒2型感染（CAV-2infectious）可引起犬的传染性喉气管炎及肺炎症状。

临床症状主要表现为持续高热、咳嗽、浆液性至黏液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎。

该病多见于4月龄以下的幼犬，可造成全窝或全群咳嗽，因此又称为“犬窝咳”。

病原1974年，Rubarth最先描述了犬的传染性肝炎。

1959年，Kapsenberg分离获得病毒，称为犬传染性肝炎病毒。

1962年，Ditchfield等分离获得单纯引起呼吸道病变（喉气管炎）而不引起肝炎的腺病毒，即A26株。

前者被称为CAV-1型，后者被称为CAV-2型。

CAV-2和CVA-1同属腺病毒属，具有典型的腺病毒对称的衣壳，直径55～80nm。

基因组为双股DNA，无囊膜。

和CAV-1相比，CAV-2纤突较长，为35～37nm。

CAV-2和CVA-1均能凝集人（O型）红细胞，前者还可凝集豚鼠红细胞。

两型均不凝集犬、小鼠、兔、绵羊、马和牛的红细胞。

二者具有共同的补体结合抗原，但其生化特性和核酸同源性彼此各异，应用血凝抑制试验和中和试验可以将其加以区别。

CAV-2对酸和热的灭活作用不敏感，能抵抗乙醚、氯仿等脂类溶剂。

CAV-2在4℃和室温下保存20d，滴度未见明显下降。

但56℃20min明显下降。

流行病学CVA-2感染主要发生在幼犬，狐狸幼仔也可被感染。

CVA-2可通过呼吸道感染，病毒在无纤毛的细支气管上皮细胞，鼻黏膜、咽喉和扁桃体隐窝的表面细胞，支气管的黏膜及肺泡上皮细胞中增殖。

还能在咽喉淋巴结和支气管淋巴结增殖。

临床症状犬腺病毒2型感染潜伏期为5～6d。

临床特征表现为持续性高热（体温在39.5℃～40℃）、精神沉郁、食欲废绝、肌肉颤抖、鼻部流浆液性鼻液、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎，并有呕吐和腹泻症状出现。

之后出现阵发性干咳，后表现湿咳并有痰液，呼吸急促。

听诊有气管啰音，口腔咽部检查颌下淋巴结肿大、扁桃体肿大、咽部红肿，病状继续发展可引起坏死性肺炎。

慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。

该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。

培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。

3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。

四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。

2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。

（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。

3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。

腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。

对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。

而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。

注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。

2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。

根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。

纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。

4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。

在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。

5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。

Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。

但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。

6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。

可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。

2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。

避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。

可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。

第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。

稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。

放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。

第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。

稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。

依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。

吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。

第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

利用293T细胞扩增腺病毒CCL22操作步骤（1）在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293T细胞。

（2）取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。

（3）移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。

（4）加入9ml DMEM5%。

（5）再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。

注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。

收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。

-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。

（6）-20℃/37℃冻融3次。

（7）转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。

（8）3个175cm2培养瓶中各加入107 293T细胞进行培养。

（9）将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。

移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。

此时MOI值约为25。

（10）加入DMEM5%至30ml。

（11）再培养48~72小时。

此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。

若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。

注：此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤。

600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。

-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

（12）移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。

成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。

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腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。

2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。

3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。

被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。

接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。

4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。

观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。

5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。

6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。

个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。

2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。

3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。

4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。

如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。

不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。

腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装
1 特点：
1.1 几乎可以感染所有类型的细胞。

1.2 可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒。

1.3 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效地进行增殖。

1.4 腺病毒载体感染宿主的范围比较广。

1.5 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。

2原理：
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

3 腺病毒包装简要流程
3.1 含有目的基因的腺病毒穿梭载体的构建和质粒纯化提取。

注：客户也可以提供构建好的重组腺病毒穿梭载体。

3.2 穿梭载体与腺病毒骨架质粒重组及鉴定。

3.3 重组腺病毒质粒的酶切线性化。

3.3 线性化的重组腺病毒质粒转染包装细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。

3.4 腺病毒扩增并纯化。

3.5 分装，- 80 oC保存。

3.6 滴度测定及无菌检测。

第一节AAV病毒的生活周期腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。

这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。

病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。

从昆虫到人类都已分离到微小病毒。

AAV病毒属于依赖性病毒类（Dependovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。

从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。

大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。

在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。

因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。

进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。

AAV的生活周期有两种不同的胞内期。

在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。

这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。

AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,19 92; Samulski et al. 1993）。

研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。

AAV病毒载体应⽤中的常见问题-重组AAV病毒的滴度测定重组AA V病毒的滴度测定⽬录⼀、重组病毒滴度表⽰形式⼆、点杂交⽅法测定重组AA V病毒滴度原理材料和⽅法三、⽤蛋⽩浓度推算重组AA V病毒滴度----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------⼀、重组病毒滴度表⽰形式重组病毒的滴度有多种表⽰形式，如cfu/ml,pfu/ml, ,IU/ml, TU/ml, particles/ml，v.g/ml, DRP/ml等。

这些滴度表⽰形式的不同主要是由于各种病毒载体的⽣物学特点不同，以及约定俗成的习惯造成的。

为了便于⽐较，⽬前国际上越来越倾向于采⽤物理滴度(如particles/ml，v.g/ml, DRP/ml等)表⽰重组病毒的滴度。

cfu: clone forming unit的缩写，克隆形成单位。

cfu/ml指1ml重组病毒液感染细胞能形成转导细胞克隆的数量。

多⽤于反转录病毒载体如LN系列。

由于该载体中有neo基因表达单位，⽤获得的重组病毒感染细胞后，可⽤G418来选择培养，通过计数G418抗性克隆数量来表⽰病毒滴度。

⽤反转录病毒载体感染细胞不会引起细胞裂解性病变，所以不⽤pfu（plaque forming unit）来表⽰滴度。

pfu：plaque forming unit的缩写，空斑形成单位。

多⽤于腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等引起细胞裂解性病变的病毒载体。

IU：infection unit的缩写。

感染单位。

TU：transduction unit的缩写。

转导单位。

Particles/ml：每ml液体中含有的病毒颗粒数。

也叫物理滴度。

其中的病毒颗粒有可能是实⼼的，也有可能是缺损的或空⼼的。

后者对转染是⽆效的。

怎么判断是不是腺病毒
腺病毒是一种常见的病毒感染，引起呼吸道感染和口腔溃疡等症状。

正确判断是否患有腺病毒感染对于及时治疗和控制传播至关重要。

以下是一些方法来判断是否患有腺病毒感染：
症状
腺病毒感染的常见症状包括：
•发热
•喉咙痛
•流感样症状，如咳嗽、头痛、肌肉疼痛
•口腔溃疡
•胃肠道症状，如腹泻或呕吐
如果出现上述症状，特别是多种症状同时存在，可能是腺病毒感染引起的。

医学检测
确诊是否患有腺病毒感染需要进行医学检测，包括：
•喉拭子检测：通过喉拭子采样检测腺病毒的核酸
•血液检测：检测血清中的抗体水平
•病毒培养：将患者样本培养出病毒进行鉴定
医生将根据检测结果和症状来判断是否是腺病毒感染。

感染途径
腺病毒主要通过飞沫传播，包括接触被感染者的口腔、鼻腔分泌物、唾液等途径传播。

因此，如果接触了患有腺病毒感染的人或者接触了被感染物体，就有可能感染腺病毒。

预防措施
预防腺病毒感染的方法包括：
•频繁洗手：勤洗手可以减少病毒传播
•避免接触患者分泌物：尽量避免接触患有腺病毒感染的人或物品
•保持健康生活习惯：良好的生活习惯有助于提高免疫力，降低感染风险
总之，通过了解腺病毒感染的症状、医学检测以及感染途径，可以更准确地判断是否患有腺病毒感染，并采取相应的预防措施。

如有疑问或症状严重，请及时就医。

呼吸道合胞病毒和腺病毒检测与分型首都儿科研究所 邓洁大家好！下面我跟大家交流一下呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测与分型方法。

呼吸道合胞病毒是属于副粘液病毒科的一种RNA病毒。

它是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一，特别是2 — 6个月的小婴儿在感染呼吸道合胞病毒以后常常可以发生严重的毛细支气管炎和肺炎。

另外呢它还是引起老年人慢性支气管炎加重以及免疫损伤患儿下呼吸道感染的重要病原。

呼吸道合胞病毒最早是在1956年在伴有感冒症状的猩猩体内分离到的。

在1957年又从患有下呼吸道疾病婴儿的鼻咽分泌物中分离到，由于它在细胞中可以引起细胞融合病变，所以呢就根据它在组织培养中的细胞病变特征呢命名为呼吸道合胞病毒。

呼吸道合胞病毒呢它是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成，其RNA全长为15225个核苷酸，编码10个蛋白。

其中呢G蛋白和F蛋白呢是位于病毒颗粒的表面，是呼吸道合胞病毒的主要糖蛋白。

呼吸道合胞病毒的抗原变异，在70年代应用动物高价免疫血清的交叉中和试验即证明呼吸道合胞病毒毒株之间存在着细微的差异。

在80年代随着特异的呼吸道合胞病毒单克隆抗体的应用，发现呢在G蛋白、F 蛋白、P蛋白以及N蛋白等蛋白上存在着抗原的变异性。

呼吸道合胞病毒亚型有什么差异呢？我们说呼吸道合胞病毒分为两个亚型A和B，它们的主要区别呢，主要是在于G、F、N、P蛋白上的抗原组成不同，其中G蛋白的可变性最高。

A和B亚型G蛋白之间仅存在5%的抗原相关性，而F蛋白则接近50%。

在氨基酸水平上，A和B亚型G蛋白只有53%的同源性，而F蛋白则为89%。

那么呼吸道合胞病毒亚型与反复感染有什么关系呢？我们说由于G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原之一，而不同亚型呼吸道合胞病毒G蛋白激发机体产生的保护性抗体呢，不能有效地提供亚型间的交叉保护作用。

所以亚型的存在呢可能是同呼吸道合胞病毒的反复感染有关。

那么呼吸道合胞病毒A、B亚型的致病性又有哪些区别呢？这都是一些文献的报道，有一些文献报道呢，说A亚型呼吸道合胞病毒呢具有较强的致病性。

禽腺病毒病的诊断与防控禽腺病毒病是一种由禽腺病毒引起的急性传染病。

该病在全球范围内广泛流行，主要感染禽类，并且对养禽业造成了严重的经济损失。

及时的诊断和有效的防控措施对于控制禽腺病毒病的传播至关重要。

本文将就禽腺病毒病的诊断和防控措施进行详细介绍。

1. 临床症状禽腺病毒病在感染后的潜伏期为2-7天，主要症状包括高热、食欲不振、饮水量增加、躯体抖动、呼吸困难、粪便异常等。

严重感染时，还会出现黄疸、神经症状和水肿等症状。

禽腺病毒病还会导致禽类的生产性能下降，生长缓慢甚至死亡。

在禽类养殖场中，如出现上述症状，应及时进行疾病的诊断。

2. 实验室检测禽腺病毒病的诊断主要通过实验室检测来进行确认。

目前常用的检测方法主要包括病毒分离和鉴定、病毒抗体检测和分子生物学检测三种方法。

（1）病毒分离和鉴定常用的病毒分离方法包括禽腺病毒的原代细胞分离、胚胎鸡卵接种、细胞培养、小鼠感染等。

通过细胞培养或小鼠感染后，检验病毒抗体滴度变化，观察细胞病变，最终确定病毒分离情况。

鉴定方法主要包括病毒形态特征、生化特性、免疫学和分子生物学特性等方面。

（2）病毒抗体检测病毒抗体检测主要通过血清学测定方法进行，包括补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、中和试验和血凝试验等。

在病毒感染后，宿主体内会产生相应的病毒抗体，通过检测抗体滴度的变化，可以判断禽类是否感染了禽腺病毒。

（3）分子生物学检测分子生物学检测主要是通过PCR技术检测感染禽腺病毒的基因或RNA序列，以确定禽类是否感染了禽腺病毒。

PCR技术具有高灵敏度、特异性和快速性的优势，是当前禽腺病毒病诊断的主要手段之一。

3. 临床病理禽腺病毒病的临床病理特点主要包括肝脏和肾脏的病理变化。

在禽类感染禽腺病毒后，常常出现肝脏和肾脏的不同程度的病变，如肝脏出现出血点、出血斑、肿胀、颜色变深等。

肾脏则出现水肿、变形、出血点和出血斑等病变。

通过临床病理检查可以为禽腺病毒病的诊断提供重要的依据。

汉恒悬浮细胞专用腺病毒操作技术文档腺病毒基本操作请参考“汉恒腺病毒操作手册”，但悬浮细胞专用腺病毒（Ads）一些特殊要点列举如下：一、悬浮细胞专用腺病毒（Ads）实验策略与关键知识点1.悬浮细胞专用：汉恒生物开发的悬浮细胞专用腺病毒针对悬浮细胞的细胞膜特性进行了腺病毒的改造，病毒感染体系也进行了相应的优化，极大改善对悬浮细胞的感染能力。

对贴壁细胞的感染能力无影响，可以通用（感染贴壁细胞请参考“汉恒腺病毒操作手册”）。

2. 超强感染效率汉恒悬浮细胞专用腺病毒对Jurkat、K562等众多悬浮培养细胞系感染效率接近100%，对血液来源原代细胞，如CD4+ T细胞感染效率可达60%以上。

3.腺病毒的细胞感染特性：1）腺病毒不插入细胞基因组，不形成稳定转染；2）腺病毒的瞬时表达能力一般为2-4周，细胞增殖越快，表达时间越短；3）由于不会随机插入损伤基因组，相比较慢病毒，腺病毒对体外培养的目的细胞毒性较小，因此可以用较高MOI来感染目的细胞。

4）高滴度：汉恒生物提供的腺病毒产品滴度较高，由于采用了汉恒特有的体系，用于细胞感染级别的腺病毒一般可以达到1010 PFU/ml滴度。

4.腺病毒细胞实验策略：由于腺病毒的非稳转性、低离体细胞毒性以及高滴度，应用腺病毒感染细胞的一般策略是：先扩增足量的目的细胞，然后用腺病毒载体感染目的细胞，待目的基因表达后直接进行后续的细胞功能性实验。

一般不会用腺病毒先感染细胞后再对细胞进行二次扩增放大化培养。

5.悬浮细胞专用腺病毒感染实验相关知识点：1）悬浮细胞准备：腺病毒建稳转细胞系前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

腺病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别。

对于悬浮细胞，腺病毒MOI 一般以30、100、300、1000、2000的比例递增进行梯度摸索，相比于贴壁细胞，悬浮细胞的腺病毒MOI需求更高，MOI梯度摸索建议用96孔板进行以节省病毒和细胞。

成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4）无需任何转染试剂，操作简便。

5）可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4）病毒的纯化和浓缩。

5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志2021年(第57卷)第1期1SOX9腺病毒过表达载体的构建及其对/ADSCs向胰岛样细胞分化的影响高登科，戴鹏秀，范志新，张霞，阮晨梅，王璟璐，张欣珂，张翊华(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100)摘要:脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能,是治疗自身免疫损伤性糖尿病的理想种子细胞。

SOX9是胰腺发育调控网络中的多潜能因子，其功能缺失可以导致胰腺发育不全和祖细胞池枯竭。

但到目前为止,SOX9在ADSCe向胰岛样细胞分化过程中是否具有重不完全$腺病毒过重组载体pAdTrack-SOX9-AdEasy，并获得了具有感染性的腺病毒毒液,将其感染犬ADSCe,感染后4%7%10%13d和16d、细胞化和胰岛！细胞发育因的$，过表达S0X9基因的腺病感染犬ADSCe后，出;并在第13细胞，在第16天出现多胰岛样细胞团；到SOX9可性I Pdx1%Ngn3%Mnx1%MafA%Nkx2.2%Nkx6.1%PCSK1和PCSK2等基因的内源性表达。

表明S"#9基因过表达腺病毒毒液可成功感染犬ADSCe，其向胰岛样细胞分化。

关键词:S0X9基因；腺病毒过表达重组载体；犬ADSCe；胰岛样细胞中图分类号：SI56.5文献标志码:A文章编号：0529—6005(2021)01—0001—05Construction of SOX9Adenovirus Overexpression Vector and its Effect on theDifferentiation of Canioe ADSCs to Islet-lite CellsGAO Deng-ke，DAI Peng-xiu，FAN Zhi-xic，ZHANG Xic，RUAN Chen-mei，WANG JingAu，ZHANG Xin-ke，ZHANG Yi-hua(CoOege of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling712100，China) Abstract:Adipose-derived mesenchymal stem celle(ADSCe)have multi-directionai differentiation potentiai and are the idea, seed celle for the treatment of autoimmune damaging diabetes.SOX9ir a multipotenhai factor in the reeulatory network of pancreatic developmentai processes，and it'e dysfunction can lead tx)pancreatic hypoplasia and depletion of progenitoe cells.But se far，ii is noi yet clear whether SOX9playe an important role in the dd'erentiation of ADSCe inte islet like cells.Therefore，in this study we con­structed adenovirue overexpression recombinani vector pAdTrack-SOX9-AdEasy，and then used the obtained infectious adenovirus vec-mr to infect canine ADSCe.The expression of green Uuorescent protein，cell morphology changes and expression of islet0cell devel­opment related genes were studied after4，7，10，13days and16days post infection.The results showed that SOX9was successfully expressed in canine ADSCe identified by green euorescent protein expression.Celle began to show aggreaate growth on the13th day，and mueiipeeceeceu&iee&appeaeed on ihe16ih day.Oueee&uei aeo&howed ihaiSOX9eiogenou&ey&iimueaied iheendogenou& expression of genes such as Pdx1，Ngn3，Mnx1J MafA，Nkx2.2，Nkx6.1，PCSK1and PCSK2.This indicates that SOO9gene overex­pression adenovirus vectoo could successfully infect canine ADSCe and promote theis diderentiation into islet like cells.Key words:SOO9gene；adenovirus overexpression recombinant vectoo；canine ADSCe；islet like celleCorresponding acthoe:ZHANG Yi-hua，E-maH:zyh19620207@糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后危害收稿日期：2020—05—05基金项目:国家自然科学基金面上项目(31872529)；陕西省自然科学基金重点项目(2019JJ-16)作者简介:高登科(1996-)，男，硕士，研究方向为临床兽医学，E-mail: 936609487@通信作者:张翊华,E-maii:zyh19620207@和动物身体的第三大疾病，是的高发分病，患病糖和糖尿，并多饮、多尿、多和体重症状［1］$虽性胰岛素治疗可以控制糖尿病的血糖升，但无法防止血糖波动引起的微病变及并发症［2］。