三聚氰胺事件案例分析
一事件概况
二蛋白质检测方法
蛋白质的理化性质及反应众多，光是显色反应就达十余种，每一种或一类性质就意味着一条检测途径，因此能够用于检测蛋白质的方法多种多样。在众多的蛋白质含量常规检测方法当中，历史最长、最为成熟的两种方法是基于氮元素含量测定的凯氏定氮法和燃烧定氮法；发展速度最快、无需样品预处理的快速检测方法首推近红外光谱法；应用最为广泛、实现最为灵活的是基于显色反应的比色法；能够对不同结构和大小的蛋白质分子进行分离检测的主要有高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳。此外，还有其它一些不常用或是非常规的方法也可用于蛋白质含量的检测。
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法是丹麦化学家 Kjeldahl 于 1883 年提出的，历经一个多世纪的发展后已逐步趋于成熟和完善。Kjeldahl 发明凯氏定氮法的最初目的是检测啤酒原料谷物中蛋白质的含量，后经多次改进检测过程不断简化、检测结果的重现性和可靠性逐步提高，最终被人们所广泛采用。目前凯氏定氮法已成为众多国家和组织机构检测蛋白质的标准方法，被各领域学者和研究人员应用于蛋白质的检测之中。
1.1 凯氏定氮法的测量原理
凯氏定氮法主要基于蛋白质中氮元素含量大致为 16%这一原理，虽然在不同的时期具体实现细节上略有不同，但大致都分为消化、蒸馏和滴定三大步骤。
“消化”的作用是将氮元素从被测样品中分离出来。其基本原理是含氮有机化合物在高温浓硫酸中被氧化为 CO2、H2O、NH3以及一些其他相关化合物，产生的 NH3进一步与
H2SO4作用生成(NH4)2SO4。由于有机化合物在高温浓硫酸中的分解过程十分缓慢，通常加入 K2SO4或 Na2SO4或来增大浓 H2SO4的沸点，以此提高反应的温度。此外还需加入 CuSO4作为催化剂，进而缩短“消化”时间。目前大多数文献和标准方法中均以 Cu 作为催化剂（Cu 和 H2SO4反应生成CuSO4），消化时间为 120 分钟左右，消化温度为 160～420℃之间。
“蒸馏”的作用是将氨从消化产物(NH4)2SO4中分离出来。其基本原理是(NH4)2SO4遇浓碱（大多用 NaOH）分解为 Na2SO4和 NH4OH，加热后 NH4OH从溶液中挥发出来分解成水蒸气和游离的 NH3，为了防止 NH3的扩散流失用一定浓度的硼酸（H3BO3）溶液吸收蒸气，H3BO3与蒸气中的 NH3结合生成碱性的NH4H2BO3（NH4+和 H2BO3–）。蒸馏是凯氏定氮法中较为关键的步骤，实验操作的准确性、游离 NH3的蒸发效率及吸收程度直接决定着检测结果的重现性和准确度。
“滴定”用于对溶液中的铵离子（NH4+）进行定量。其基本原理是 NH4H2BO3与强酸反应生成中性的铵盐和 H3BO3。一般采用标准浓度的 HCl 或 H2SO4对NH4H2BO3溶液进行滴定，根据消耗 HCl 或 H2SO4的量计算出氨的含量，进一步折算成氮的含量以后根据蛋白质中氮元素的比例，最终推算出被测样品中蛋白质的含量。
1.2 凯氏定氮法的优点和局限性
凯氏定氮法之所以能历经一百二十多年仍在广泛流传主要是因为它具有应用范围广、重现性好、准确度高、灵敏度高、样品用量少等众多优点。从国内外的研究与应用现状可以看出，不论被测样品是固体、溶液、或是浑浊液凯氏定氮法都能适用；对同一样品的多次测量的重现性好、平行度高，平行误差极小；检测限低、灵敏度高，对氮的最低检测限低于 50 ug。
同样从国内外的研究和应用状态也可以看出，凯氏定氮法主要局限于样品中总蛋白的检测。从凯氏定氮法的基本原理可以看出，“消化”其实质是一个氧化过程，除了蛋白质以外，其它能被浓硫酸氧化的含氮化合物在消化的过程中也会产生(NH4)2SO4，即凯氏定氮法测量的是总有机氮。因此凯氏定氮法测量总蛋白时极易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰，例如被测样品中含有尿素、碳酸铵、氯化铵等物质时检测结果就不准确[1]，据说当年的三鹿公司就是采用凯氏定氮法来检测原料奶中蛋白质的含量，而没能检出原奶中添加的三聚氰胺[2]。要去除非蛋白氮的干扰，一般先添加三氯乙酸等溶液将蛋白质变成沉淀过
滤掉[3]，然后再次采用凯氏定氮法或其它的方法测量出滤液中的非蛋白氮，扣除掉非蛋白氮的含量以后才能得到被测样品中总蛋白的含量。
由于构成蛋白质的氨基酸的含氮量不尽相同，将氮元素的含量折算成蛋白质的含量时折算系数选择不当也会带来较大的误差。例如小分子量氨基酸、碱性氨基酸和氨基酸酰胺的含氮量高于氨基酸的平均含氮量，这样的氨基酸含量较大时会导致折算出的蛋白质含量比实际值偏高。
此外，凯氏定氮法的操作略显繁琐，测量时间比较长，不利于对大批量样品的快速测量。2 燃烧定氮法
燃烧定氮法是法国化学家 Dumas于 1831 年首创的一种含氮化合物的定量检测方法，经 Erdman和 Schitt改进后逐渐成熟。早期的燃烧定氮法只能测量几毫克的样品，直到1989 年德国的贺利氏（Heraeus）公司生产出可以测量克级样品的杜马斯快速定氮仪，燃烧定氮法才在食品、饲料、土壤、临床等各个领域广泛应用起来。
2.1 燃烧定氮法的测量原理
早期的燃烧定氮法由“燃烧”、“还原”、“净化”、“检测”四个环节组成。经过一百多年的发展后，总结近 10 年来的相关文献，结合当前分析仪器界先进的测控手段和成熟的检测技术，现代化或是未来的燃烧定氮仪分为“燃烧”、“净化”、“分流”、“还原”、“分离”、“检测”六个步骤，其结构如图 1.2 所示，荷兰 Skalar公司生产的 PrimacsSN 型“总氮—蛋白质分析仪”就是采用类似的结构。
“燃烧”是将被测样品氧化消解的一种化学反应过程。燃烧炉的温度一般为900～1200℃，助燃气为高纯氧气，进样后被测样品在炉内高纯氧气中剧烈燃烧，产生 H2O 、CO、CO2、N2O、NO、N2O3、NO2、N2O4、N2O5以及硫、磷、氯等其它少量或微量含氧气体。为了使氧化更加充分、使不稳定的含氧气体转化为更加稳定的含氧气态物质，一般在燃烧炉后加
