猪伪狂犬病病毒PCR-LFD检测方法的建立及应用

动物医学进展,２０１８,３９(１１):３５Ｇ４０P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y Me d i c i n e 猪伪狂犬病病毒P C R ＧL F D 检测方法的建立及应用㊀收稿日期:２０１８Ｇ０１Ｇ２４㊀基金项目:天津市科技计划支撑项目(１８Y F Z C N C ０１１１０);天津市农业科技成果转化与推广项目(２０１６０１０７０);天津市生猪产业技术体系项目(I T T P R S ２０１７００３);中国农业科学院重大平台推进计划(Y ２０１７P T ５０)㊀作者简介:张㊀莉(１９７９－),女,河北邢台人,副研究员,硕士,主要从事畜禽疾病研究.∗通讯作者张㊀莉,任卫科,李秀丽,路㊀超,王利丽,郑㊀丽,池晶晶,田向学,韩㊀伟,鄢明华∗(１．农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站,天津３００３８１;２．天津市畜牧兽医研究所,天津３００３８１)㊀㊀摘㊀要:旨在将P C R 技术与可视化的横向流动试纸条(l a t e r a l f l o wd i p s t i c k ,L F D )相结合,建立猪伪狂犬病病毒野毒株的P C R ＧL F D 快速检测技术.依据猪伪狂犬病病毒g E 基因保守区域设计２条特异性引物和对应的特异性探针,其中下游引物和探针分别标记了荧光素(F I T C )和生物素(B i o t i n ).通过对P C R 退火温度㊁引物浓度㊁探针杂交温度的筛选,确定P C R ＧL F D 方法的最佳反应条件,并对其敏感性㊁特异性和重复性进行检测.结果显示,所建立的检测方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株,与猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株㊁６种对照病毒和３种对照细菌均无交叉反应,其最低检测限为１００TC ID ５０/１００μL .该方法对同批次和不同批次猪伪狂犬病病毒D N A 分别进行５次重复检测,结果完全一致.该方法对５０份临床样品进行检测,P C R ＧL F D 方法和病毒分离培养法检测出１６份阳性样品,常规P C R 检测出１４份阳性样品,P C R ＧL F D 方法的敏感性高于P C R ,但两者间差异不显著P ＞０．０５.以上结果表明,所建立的方法具有良好的特异性㊁敏感性和重复性,且不需要琼脂糖凝胶电泳可直接判读结果,适合养殖场㊁基层实验室的现场检测.㊀㊀关键词:猪伪狂犬病病毒;聚合酶链反应;横向流动试纸条中图分类号:S ８５２．６５文献标识码:A文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０１８)１１Ｇ００３５Ｇ０６㊀㊀猪伪狂犬病(P s e u d o r a b i e s ,P R )是由疱疹病毒科㊁αＧ疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒(P s e u d o r a b i e sv i u r s e ,P R V )引起的多种动物的一种高度接触性传染病[１].猪是自然宿主.该病可导致怀孕母猪的流产㊁死胎㊁木乃伊胎和种猪不育等症状;哺乳仔猪常出现神经症状和死亡;成年猪一般呈亚临床或隐性感染,成为病毒的贮存宿主,长期排毒,但是自２０１１年后,我国多地区猪场中出现伪狂犬病病毒变异毒株,一些成年猪也出现神经症状和高病死率等情况[２Ｇ３].猪伪狂犬病流行状况的变化给养猪业带来了巨大损失,因此,特异㊁敏感㊁快速的诊断方法对该病的防控至关重要.目前,伪狂犬病的诊断方法有很多种,其中g E ＧE L I S A 方法和g B ＧE L I S A 常用于猪群的免疫抗体监测和预警,P C R 方法和荧光定量P C R 则是病原学诊断的主要方法[４].P C R ＧL F D 技术是将P C R 技术㊁核酸探针杂交技术与横向流动试纸条(l a t e r a lf l o wd i p s t i c k ,L F D )三项技术相结合,应用试纸条直接检测P C R 扩增产物的技术.此项技术已在结核分支杆菌[５]㊁甲型H １N １病毒[６]㊁乙型肝炎病毒[７]㊁转基因黑曲霉[８]㊁口蹄疫病毒[９]等方面有了成功应用的报道.本研究根据猪伪狂犬病病毒的g E 基因设计一套引物和探针,建立了猪伪狂犬病病毒的P C R ＧL F D 特异性检测方法,为伪狂犬病的诊断提供了一种更为便捷的病原检测方法.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀供试病毒株和菌株㊀猪伪狂犬病病毒(P R V )S C 株,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队赠送;猪圆环病毒２型(P C V Ｇ２)㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V )㊁猪细小病毒(P P V )㊁猪流感病毒(S I V )㊁猪伪狂犬病病毒(P R V )R １３０２８株㊁猪伪狂犬病病毒(P R V )R １３１３９株㊁猪肺炎支原体(M P )㊁副猪嗜血杆菌(H ps )均由天津市畜牧兽医研究所实验室保存;猪链球菌２型(S S ２)㊁猪伪狂犬病病毒(P R V )M i n A 株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心;猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(P R V g E 基因缺失株)㊁日本脑炎病毒(J E V )㊁猪瘟病毒(C S F V )疫苗株为市售疫苗.１．１．２㊀主要试剂㊀r T a q DN A 聚合酶㊁d N T P ㊁２X G C b u f f e r I ㊁D N A M a r k e rD L２０００,宝生物工程(大连)有限公司产品;核酸提取试剂盒,金瑞鸿捷生物科技有限公司产品;横向流动试纸条,杭州忧思达生物技术有限公司产品.１．２㊀方法１．２．１㊀引物设计与合成㊀根据G e n B a n k 数据库中猪伪狂犬病病毒g E 基因(G e n B a n k :A Y １７３１２４)中的一段保守核苷酸序列,采用P r i m e rP r e i m e r ５．０软件设计特异性P C R 引物和探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成(表１).表１㊀引物序列T a b l e １㊀P r i m e r s e qu e n c e s 项目I t e m引物名称P r i m e r n a m e s序列(５ᶄＧ３ᶄ)S e qu e n c e s (５ᶄＧ３ᶄ)５ᶄ标记５ᶄL a b e l 扩增片段/b pA m p l i f i c a t i o n f r a gm e n t P C R P R V g E ２４７(上游)C C G G C C C A T C T G G T G A A C G T３３７P r i m e r sP R V g E ６２３(下游)C C C A C C G C C A C A A A G A A C A C GF I T CP C RP r o b eP r v ＧT Ｇb i oG A C C T G G T G C T G G G C C G C G C C T B i o t i n１．２．２㊀P C R ＧL F D 方法的建立㊀１．２．２．１㊀P C R 反应条件优化㊀P C R 反应体系为２０μL :１０μL２ˑG Cb u f f e r I ,０．５μLr T a q D N A 聚合酶(８U /μL ),２μL d N T P s (２．５mm o l /L ),１μL P R V g E ２４７(１０μm o l /L ),１μL P R V g E ６２３(１０μm o l /L ),５．０μL 模板D N A ,０．５μL 超纯水.P C R 反应程序为:９５ħ５m i n ;９４ħ３０s ,５３ħ至６０ħ３０s ,７２ħ３０s ,进行３０个循环;７２ħ延伸５m i n ,４ħ５m i n.１．２．２．２㊀退火温度的优化㊀固定其他条件不变,设定５３㊁５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６０ħ共８个温度梯度,分别进行扩增,同时设立空白水对照.P C R 反应结束,取８μLP C R 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察并记录结果.１．２．２．３㊀引物浓度的优化㊀经上述筛选出最佳退火温度后,固定反应体系其他试剂的添加量,对引物浓度用量设定为０．５μL ㊁１μL ㊁１．５μL ㊁２μL ,并设立空白水对照.反应结束,用琼脂糖凝胶电泳检测结果.１．２．２．４㊀探针杂交反应条件优化㊀P C R 反应结束后,开盖加入１μLP r v ＧT Ｇb i o (１０μm o l /L ),增加一步杂交反应,９４ħ３０s ,５４ħ至６０ħ３０s ,４ħ５m i n .复性温度选择５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６０ħ分别进行杂交,摸索最佳反应条件.１．２．２．５㊀L F D 试纸条检测P C R 产物㊀杂交反应结束后,取P C R 产物１０μL 加入到１００μL 缓冲液,混合均匀;将L F D 试纸条插入缓冲液３m i n ;取出将试纸条水平放置,５m i n ~１０m i n 内读取结果.判定标准:质控线和检测线显现棕红色条带,为阳性;只有质控线显现棕红色条带,为阴性;只出现检测线为无效.１．２．３㊀特异性试验㊀用已优化的P C R 反应体系检测伪狂犬病病毒(P R V )S C 株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３０２８株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３１９３株㊁伪狂犬病病毒(P R V )M i n A 株㊁猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(P R V g E 基因缺失株)㊁猪瘟病毒(C S F V )㊁猪圆环病毒２型(P C V Ｇ２)㊁猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V )㊁猪细小病毒(P P V )㊁日本脑炎病毒(J E V )㊁猪流感病毒(S I V )㊁猪肺炎支原体(M P )㊁副猪嗜血杆菌(H ps )㊁猪链球菌２型(S S ２).探针杂交后,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 分别检测扩增产物,确定所建立方法的特异性.１．２．４㊀敏感性试验㊀将已知T C I D ５０的伪狂犬病病毒稀释为１０５~１０１个T C I D ５０,按常规方法提取D N A ,分别取５μL 作为模板,其他反应条件不变进行P C R扩增.探针杂交后,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 分别检测扩增产物,确定所建立方法的敏感性.１．２．５㊀琼脂糖凝胶电泳法和L F D 试纸条灵敏度比较㊀以伪狂犬病病毒S C 株D N A 为模板,按照优化后的P C R 条件进行扩增,反应结束后,测定P C R 扩增产物的核酸含量,并用纯水做１０倍㊁１００倍㊁１０００倍稀释.分别取出２０μL 稀释产物,加入１μL 核酸探针,探针杂交反应后,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 试纸条分别检测扩增产物,比较两种方法的差异.１．２．６㊀重复性试验㊀采用同一批次和不同批次提取的猪伪狂犬病病毒D N A 作为模板分别进行５次P C R 扩增,用琼脂糖凝胶电泳法和L F D 法检测扩增产物,确定所建立P C R ＧL F D 方法的重复性.１．３㊀临床样品的检测从养殖场采集５０份病料样品,用病毒分离培养法和P C R ＧL F D 方法同时进行检测,比较两种方法的符合率.６３动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第１１期(总第３０５期)２㊀结果２．１㊀退火温度的优化选择５３ħ~６０ħ８个复性温度进行扩增,结果显示５６ħ和５５ħ均能扩增出特异的目的条带,而且５６ħ亮度最强,因此,最终确定５６ħ为最适反应温度(图１).１~８．６０ħ㊁５９ħ㊁５８ħ㊁５７ħ㊁５６ħ㊁５５ħ㊁５４ħ㊁５３ħ;９．阴性对照;M．D N A 标准D L２０００１Ｇ８．６０ħ,５９ħ,５８ħ,５７ħ,５６ħ,５５ħ,５４ħ,５３ħ;９．N e g a t i v ec o n Ｇt r o l ;M．D N A M a r k e rD L２０００图１㊀复性温度优化F i g ．１㊀O p t i m i z a t i o no f t h e a n n e a l i n g t e m pe r a t u r e ２．２㊀引物浓度的优化固定P C R 体系中其他试剂的添加量,将引物浓度用量设定为０．５㊁１㊁１．５㊁２μL 分别进行P C R 扩增,结果显示,加入０．５μL 引物时,扩增条带稍浅;加入１㊁１．５㊁２μL 引物时,扩增条带均清晰,无明显引物二聚体,因此,１μL 为最佳引物添加量(图２).１．２μL 引物(阳性对照);２．２μL 引物(阴性对照);３．１．５μL 引物(阳性对照);４．１．５μL 引物(阴性对照);５．１μL 引物(阳性对照);６．１μL引物(阴性对照);７．０．５μL 引物(阳性对照);８．０．５μL 引物(阴性对照);M．D N A 标准D L２０００１．２μL p r i m e r (p o s t i v e c o n t r o l );２．２μL p r i m e r (n e g n a t i v ec o n t r o l );３．１．５μL p r i m e r (p o s t i v e c o n t r o l );４．１．５μL (n e g n a t i v ec o n t r o l );５．１μL p r i m e r (p o s t i v ec o n t r o l );６．１μL (n e g n a t i v ec o n t r o l );７．０．５μL p r i m e r (p o s t i v ec o n t r o l );８．０．５μL (n e g n a t i v ec o n t r o );M．D N A M a r k e rD L２０００图２㊀引物浓度优化F i g ．２㊀O pt i m i z a t i o no f t h e p r i m e r c o n c e n t r a t i o n ２．３㊀探针杂交反应条件优化P C R 反应液中加入标记B i o t i n 的探针,复性温度选择５４㊁５５㊁５６㊁５７㊁５８㊁５９㊁６０ħ分别进行杂交,然后用L F D 试纸条检测,结果５４㊁５９㊁６０ħ试纸条检测线未出现阳性条带,５５㊁５６㊁５７ħ时检测线有明显阳性带,但５５ħ和５６ħ的检测线较浅,５７ħ检测线最为明显,因此认为９４ħ３０s ,５７ħ３０s ,４ħ５m i n为最佳的探针杂交反应程序(图３).１~７．５４ħ㊁５５ħ㊁５６ħ㊁５７ħ㊁５８ħ㊁５９ħ㊁６０ħ;８．阴性对照１Ｇ７．５４ħ,５５ħ,５６ħ,５７ħ,５８ħ,５９ħ,６０ħ;８．N e gn a t i v e c o n t r o l 图３㊀探针杂交温度筛选试验结果F i g ．３㊀T e m p e r a t u r e s c r e e n i n g te s t r e s u l t s of p r o b eh yb r i d i z a t i o n r e ac t i o n ２．４㊀特异性试验本试验建立的猪伪狂犬病病毒P C R ＧL F D 检测方法检测伪狂犬病病毒(P R V )S C 株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３０２８株㊁伪狂犬病病毒(P R V )R １３１９３株㊁伪狂犬病病毒(P R V )M i n A 株㊁猪伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(P R V g E 基因缺失株)㊁猪瘟病毒(C S F V )㊁猪圆环病毒２型(P C V Ｇ２)㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S )㊁猪细小病毒(P P V )㊁日本乙型脑炎病毒(J E V )㊁猪流感病毒(S I V )㊁猪肺炎支原体(M P )㊁副猪嗜血杆菌(H p s )㊁猪链球菌２型(S S ２).从图４可见所建立的P C R ＧL F D 方法只能检测到伪狂犬病病毒S C 株㊁R １３０２８株㊁R １３１３９株㊁M i n A 株,伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株和其他对照菌毒株均为阴性,采用琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法观察的检测结果完全一致.２．５㊀敏感性试验从图５可见,所建立的P C R 方法的最低检测病毒滴度为１０２T C I D ５０/１００μL ,且采用琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法的检测结果完全一致.２．６㊀琼脂糖凝胶电泳法和L F D 试纸条灵敏度比较用核酸蛋白测定仪测定伪狂犬病病毒P C R 扩增产物的核酸含量为４８２．５n g /μL ,将其稀释１０倍㊁１００倍㊁１０００倍后,用琼脂糖凝胶电泳和L F D 试纸７３张㊀莉等:猪伪狂犬病病毒P C R ＧL F D 检测方法的建立及应用条分别检测,结果见图６.从图中可看出当P C R 产物稀释１００倍后,已很难通过琼脂糖凝胶电泳观察到阳性结果,但是L F D 试纸条仍可见较为清晰的红色检测线.说明L F D 试纸条的灵敏度是琼脂糖凝胶电泳的１０倍.A．琼脂糖凝胶电泳检测;B ．L F D 试纸条检测;１．伪狂犬病病毒S C 株;２．伪狂犬病病毒M i n A 株;３．伪狂犬病病毒R １３０２８株;４．伪狂犬病病毒R １３１３９株;５．伪狂犬病病毒B a r t h a ＧK ６１株(g E );６．猪圆环病毒２型;７．猪瘟病毒;８．日本乙型脑炎病毒;９．细小病毒;１０．猪繁殖与呼吸综合征病毒;１１．猪流感病毒;１２．猪肺炎支原体;１３．副猪嗜血杆菌;１４．猪链球菌２型;１５．空白对照;M．D N A 标准D L２０００A．A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ;B ．L F Ds t r i p s ;１．P R VS Cs t r a i n ;２．P R V M i n As t r a i n ;３．P R V R １３０２８s t r a i n ;４．P R V R １３１３９;５．P R VB a r t h a ＧK ６１s t r a i n (g E Ｇ);６．P C V Ｇ２;７．C S F V ;８．J E V ;９．P P V ;１０．P R R S V ;１１．S I V ;１２．M P ;１３．H p s ;１４．S S ２;１５．N e gn a t i v e c o n t r o l ;M．D N A M a r k e rD L２０００图４㊀P C R 特异性试验F i g ．４㊀S p e c i f i c i t y te s t of P CR A．琼脂糖凝胶电泳检测;B ．L F D 试纸条检测;１．阴性对照;２~６．１０１T C I D ５０~１０５T C I D ５０;M．D N A 标准D L２０００A．A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ;B ．L F Ds t r i p s ;１．N e g n a t i v e c o n t r o l ;２Ｇ６．１０１T C I D ５０Ｇ１０５T C I D ５０;M．D N A M a r k e rD L２０００图５㊀P C R ＧL F D 方法敏感性试验F i g ．５㊀S e n s i t i v i t y te s t of P C R ＧL F D m e t h od A．琼脂糖凝胶电泳检测;B ．L F D 试纸条检测;１．阴性对照;２~４．１０３,１０２,１０稀释的P C R 产物;５．原倍P C R 产物;M．D N A 标准D L２０００A．A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ;B ．L F Ds t r i p s ;１．N e g n a t i v e c o n t r o l ;２Ｇ４．P C R p r o d u c t s d i l u t e d １０３,１０２,１０t i m e s ;５．T h e o r i gi n a l t i m eP C R p r o Ｇc u c t s ;M．D L２０００D N A M a r k e r图６㊀琼脂糖凝胶电泳法与L F D 试纸条法灵敏度比较试验F i g ．６㊀T h e s e n s i t i v i t y c o m p a r i s o no f a g a r g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n dL F Ds t r i p s a n a l ys i s ８３动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第１１期(总第３０５期)２．７㊀重复性试验取同一次和不同时间提取的猪伪狂犬病病毒D N A各５份,将其作为模板进行５次P C R扩增,用L F D试纸条和琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物,两种方法结果完全一致,说明所建立的P C RＧL F D方法具有良好的重复性.２．８㊀临床样品的检测对养殖场送检的５０份病料样品用P C R㊁病毒分离培养法和P C RＧL F D方法同时进行检测,结果P C R检测到１４份阳性,而病毒分离培养法和P C RＧL F D方法为１６份,P C RＧL F D方法的敏感性要高于常规P C R方法.从表２可见P C RＧL F D方法与病毒分离培养法的符合率为１００％,与常规P C R方法的阳性符合率为１００％,阴性符合率为９４．４％.用S P S S１７．０软件对结果进行评估,P C RＧL F D方法与P C R的χ２为０．１９０４,P＞０．０５,两种方法无显著差别.表２㊀两种方法检测结果比较T a b l e２㊀C o m p a r i s o n r e s u l t s o f t w om e t h o d s检测方法D e t e c t i o nm e t h o d s P C RＧL F D P C R病毒分离培养法V i r u s i s o l a t i o nm e t h o d 阳性数P o s t i v e s a m p l e s１６１４１６阴性数N e g a t i v e s a m p l e s３４３６３４阳性符合率/％P o s t i v e c o i n c i d e n c e r a t e１００１００１００阴性符合率/％N e g a t i v e c o i n c i d e n c e r a t e１００９４．４１００３㊀讨论猪伪狂犬病是危害养猪业发展的重要传染病之一.对猪伪狂犬病病毒进行快速㊁及时㊁准确的诊断,是有效防控该病的重要前提.伪狂犬病病毒g E 基因是其主要毒力决定因子,为病毒复制的非必需基因,也是世界动物卫生组织(O I E)所规定基因缺失疫苗的缺失基因.以g E序列作为靶序列建立的诊断技术,能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染[３].王香玲等[１０]根据猪伪狂犬病病毒g E基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病病毒野毒株与基因缺失疫苗株的P C R检测方法,该方法的敏感性为１．１p g,有较高的特异性.张志等[１１]建立了能够特异性检测P R V野毒株的套式P C R方法,该方法检测极限可达１０个病毒拷贝/μL.田云等[１２]建立检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量P C R方法,该方法的灵敏度可达４拷贝.常规P C R方法检测成本低,但需要琼脂糖凝胶电泳观察结果,且有时会出现假阳性结果.荧光定量P C R虽然敏感性高于P C R,可实时观看检测结果,但是需要昂贵的设备和试剂成本,不适用于基层实验室和规模化猪场使用.本研究建立了一种基于猪伪狂犬病病毒g E基因的P C RＧL F D检测方法,该方法是将P C R技术与L F D试纸相结合的一种可视化检测方法,在引物设计时将一条引物标记了异硫氰酸荧光素(F I T C),在P C R反应后,体系中加入了一条标记生物素(B i oＧt i n)的探针,只有目的基因的P C R扩增产物才能与探针结合.采用试纸条对P C R扩增产物进行检测,杂交形成的复合体带有B i o t i n和F I T C两种标记,用试纸条检测时检测线和质控线均出现棕红色条带.阴性P C R产物㊁假阳性P C R和引物二聚体不具有双重标记,不能与检测线结合,检测线不显色.该方法在P C R扩增后１５m i n内即可目测判定结果,与传统凝胶电泳法相比更快速,且避免使用溴化乙锭(E B)等核酸染料造成的环境污染[８].为了避免P C R结果出现假阳性,本研究在P C R扩增完成以后,增加了特异性探针杂交反应,进一步提高了该方法的特异性.试验结果表明,该方法可特异性检测猪伪狂犬病病毒野毒株,与缺失g E基因的B a r t h aＧK６１株和其他９种猪病病原无交叉反应.此外,对比L F D试纸条法和琼脂糖凝胶电泳法对P C R扩增产物检测结果的灵敏度发现, P C RＧL F D方法的最低检测限度为１００T C I D５０/１００μL,其敏感性比应用琼脂糖凝胶电泳方法高１０倍.针对２０１１年以来流行的猪伪狂犬病病毒变异株分子特征发生变化的特点,在试验中分别对伪狂犬病病毒经典强毒双城株(S C株)和闽A株(M i n A 株),新分离的猪伪狂犬病变异强毒R１３１３９和R１３０２８株,以及猪伪狂犬病病毒缺失g E基因的疫苗株B a r t h aＧK６１进行了检测,结果仅B a r t h aＧK６１株检测结果为阴性,其他４株P R V检测结果均为阳性,表明建立的方法适用于P R V经典强毒和变异的强毒株的检测.以上结果表明,本研究建立的伪狂犬病病毒P C RＧL F D检测方法具有敏感㊁快速㊁特异等特点,且操作简便㊁无需电泳可直接观察结果,可用于实验９３张㊀莉等:猪伪狂犬病病毒P C RＧL F D检测方法的建立及应用室㊁养殖场和基层兽医部门对伪狂犬病的诊断和监测预警,具有广阔的应用前景.参考文献:[１]㊀A nTQ,P e n g JM,T i a nZ J,e t a l．P s e u d o r a b i e s v i r u s v a r i a n t i nB a r t h aＧK６１Ｇv a c c i n a t e d p i g s,C h i n 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dD i a g n o s i sT e c h n o l o g y,T h eM i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e o f t h eP e o p l e̓sR e p u b l i c o f C h i n a,T i a n j i n,３００３８１,C h i n a;２．T i a n j i nI n s t i t u t e o f A n i m a l S c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e,T i a n j i n,３００３８１,C h i n a)A b s t r a c t:T h e e x p e r i m e n tw a s a i m e d t oe s t a b l i s ha r a p i dP C RＧL F D m e t h o d f o r t h ed e t e c t i o no f p s e u d o r aＧb i e s v i r u sw i l dＧt y p e s t r a i n s b a s e d o n t h e P C R m e t h o d a n d v i s u a l i z a t i o nb y a l a t e r a l f l o wd i p s t i c k(L F D)．I n t h i s s t u d y,t w os p e c t i f i cP C R p r i m e r s a n do n en u c l e i c a c i d p r o b ew e r ed e s i g n e db a s e do n t h e c o n s e r v a t i v e r e g i o n s o f g E g e n eo f p s e u d o r a b i e sv i r u s,d o w n s t r e a m p r i m e ra n dn u c l e i ca c i d p r o b e w e r er e s p e c t i v e l y l a b l e db y f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e(F I T C)a n db i o t i n．T h eo p t i m u m r e a c t i o nc o n d i t i o n so fP C RＧL F D m e t h o dw e r e d e t e r m i n e db y s c r e e n i n g t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e o f P C R,t h e c o n c e n t r a t i o no f p r i m e r s a n d t h eh y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e o f t h e p r o b e,w h i l e i t s s p e c i f i c i t y,s e n s i t i v i t y a n d r e p r o d u c i l b i l i t y w e r e t e s t e d．T h e r e s u l t s s h o w e do n l yp s e u d o r a b i e s v i r u sw i l dＧt y p e s t r a i n sw e r e p o s i t i v e,a n dn o c r o s sＧr e a c t i o nw e r e o bＧs e r v e dw i t ht h eP R VB a r t h aＧK６１s t r a i na n do t h e rs i xc o n t r o lv i r u ss t r a i n sa n dt h r e ec o n t r o lb a c t e r i a l s t r a i n s．T h e s e n s i t i v i t y o f t h ea s s a y w a s１００TC I D５０/１００μL．T h i s m e t h o dh a df i v er e p e a t e dt e s t sf o r t h e s a m eb a t c ha n dd i f f e r e n t b a t c ho f p s e u d o r a b i e sv i r u sD N A,a n d t h e r e s u l t sw e r e i d e n t i c a l．F o r t h e５０s u sＧp e c t e d s a m p l e s,１６p o s i t i v e s a m p l e sw e r e i d e n t i f i e d b y P R V i s o l a t i o n a n d t h e P C RＧL F Ds t r i p m e t h o d,w h i l e １４p o s i t v e s a m p l e sw e r e i d e n t i f i e db y r e g u l a rP C R．T h eP C RＧL F D m e t h o dh a dh i g h e r s e n s i t i v i t y t h a nt h e P C R,b u t P＞０．０５,t h a tw a sn o t i ns i g n i f i c a n t l e v e l．T h ea b o v e r e s u l t s i n d i c a t e dt h a t t h em e t h o do fP C RＧL F Df o rd e t e c t i n gp s e u d o r a b i e sh a s g o o ds p e c i f i c i t y,s e n s i t i v i t y a n dr e p e a t a b i l i t y,a n d i td o e sn o t r e q u i r ea g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s t o r e a d t h e r e s u l t s,w h i c h i s s u i t ab l e f o r f i e l d t e s t i n g o f f a r ma n db a s i cＧl e v e l l aＧb o r a t o r y．K e y w o r d s:P s e u d o r a b i e s v i r u s;P C R;L F Ds t r i p０４动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第１１期(总第３０５期)。