GFP蛋白实验报告

GFP(绿色荧光蛋白基因)的免疫印迹-1[实验原理]免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。

第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。

第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分。

第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。

免疫检测的方法可以是直接的和间接的。

现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（Ap）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）染色，再加酶的底物显色，通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。

为了使初学者能够在实验过程中观察到所要检测的目的蛋白，本实验使用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以保持GFP的天然活性，利用荧光对其进行追踪。

此外，实验中用国产的HRP标记的蛋白A取代第二抗体，以节省费用。

蛋白A是从细菌分离的一种能识别多种动物IgG的蛋白，在许多场合它都可以作为第二抗体的替代物。

同样是为了节省费用，实验中用醋酸纤维素膜（AC膜）代替硝酸纤维素膜（NC膜），这样要便宜得多，而效果却无大差别。

第一部分：GFP抽提物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳，除试剂中不含SDS及蛋白样品不加热处理外，其余的与SDS-PAGE几乎相同。

因为要做免疫印迹，电泳结束后，凝胶不染色，而是做转移电泳。

[仪器、材料和试剂](一)仪器与器材1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子2．电泳仪3．微波炉4．小型高速离心机5．专用紫光灯（BIO-RAD公司）6．枪，枪头，1.5mL 离心管(二)材料1．蛋白样品：GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀(三)试剂1．1.5mo1／L Tris•HCl pH 8.82．0.5mo1／L Tris•HCl pH 6.83．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）.. 95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

生物技术综合大实验实验报告GFP的分离与纯化姓名：专业班级院系：指导教师：完成日期GFP的分离与纯化摘要： GFP，在生物领域应用广泛。

本实验回顾了GFP提取纯化过程，包括细菌破碎、GFP沉淀、疏水过滤层析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析等步骤，来获得较纯的GFP，并运用SDS-PAGE来检测纯化效果。

关键词：GFP 应用进展层析 SDS-PAGE绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。

1962年Shimomura等首先从多管水母(Aequorin victoria)中分离出一种分子量为20kDa的称为Aequorin的蛋白。

由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。

1992年Prasher 等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构；1994年Chalfie 等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；1997年10月18~22日在美国New—Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。

1994年钱永健改造了GFP，使得GFP的荧光变强、变色。

由此和Shimomura、Martin Chalfie共享了2008年诺贝尔化学。

从此，荧光蛋白带来了生物技术的新革命。

GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白，分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽。

在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；发射光谱λmax=508~509nm。

GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。

其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。

gfp报告基因GFP (Green Fluorescent Protein) 是一种来源于水母的蛋白质，它因其强烈的绿色荧光特性而备受研究者们的喜爱。

通过观察GFP 在生物体内的表达情况，科学家可以了解基因的功能、活性以及细胞的生长与分化情况。

在这篇文章中，我们将深入探讨GFP 报告基因的意义和应用。

GFP最初在1962年被發现，其荧光特性的发现对生物学领域带来了革命性的影响。

与其他荧光探测技术相比，GFP 是一种非侵入式探针，因为它并不需要与其他荧光染料或化学物质相结合才能发出荧光。

这使得研究者能够直接观察目标生物内的蛋白质。

通过将 GFP 基因导入目标生物体内，科学家们可以通过其发出的荧光来追踪蛋白质的表达情况以及其在细胞中的位置。

GFP 报告基因的应用可谓广泛且多样。

首先，GFP 提供了一种非常强大的工具来研究基因的表达与调控。

通过将 GFP 基因与其他特定的目标基因结合，科学家可以实时观察到基因在不同阶段中的表达情况。

这对于研究细胞周期、基因调控机制以及疾病发展过程中的基因表达有着重要的意义。

其次，GFP 报告基因也被广泛应用于研究生物体的发育过程。

通过在受精卵中导入 GFP 基因，研究者能够观察到胚胎在不同发育阶段中细胞的生长、分化以及器官形成等过程。

这不仅有助于对发育生物学的理解，还为研究异常胚胎发育以及基因治疗提供了平台。

除了基础研究领域外，GFP 还在许多应用领域发挥了重要作用。

例如，在药物开发中，通过将 GFP 基因引入药物靶标细胞中，科学家们能够直观地观察到药物分子在细胞中的作用和效果，从而提高药物研发效率。

此外，GFP 还广泛应用于植物学和环境科学领域，研究植物的生长、环境污染和气候变化等问题。

然而，尽管 GFP 的应用广泛，但也存在一些挑战和限制。

首先，GFP 报告基因技术并非完美，它有可能对目标生物体的正常生理过程产生干扰，从而导致不准确的结果。

此外，GFP 只能用于活体观察，不能提供关于目标蛋白质的详细结构和功能信息。

分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。

此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。

本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。

在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。

表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。

绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。

所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。

将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。

关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。

1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。

长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。

1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。

GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。

基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。

GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。

本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。

其上有所用酶的酶切位点。

gfp表达质粒的构建实验报告1.实验目的本实验旨在构建含有绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒，以便在细胞中实现GFP的高效表达，为后续的生物荧光成像等应用提供支持。

2.实验原理质粒是一种小型、自主复制的DNA分子，可与细菌染色体DNA分离。

质粒上有多个限制性酶切位点，可用于插入外源基因。

通过将目的基因插入质粒，并导入受体细胞，可以实现目的基因的表达。

本实验将使用含有GFP基因的质粒，将其导入大肠杆菌细胞中，使其表达出绿色荧光蛋白。

3.实验材料3.1仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅。

3.2试剂：质粒提取试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶Ⅰ、dNTPs、电泳缓冲液、琼脂糖凝胶。

3.3细胞系：大肠杆菌细胞。

4.实验步骤4.1获取含有GFP基因的质粒：从公共数据库中获取含有GFP基因的质粒序列，并通过PCR扩增获得大量质粒。

4.2酶切质粒：使用限制性核酸内切酶对质粒进行酶切，获得含有GFP基因的片段。

4.3连接质粒：将酶切后的质粒片段与连接酶的作用下，将其连接至具有相同黏性末端的大肠杆菌质粒上。

4.4转化大肠杆菌：将连接后的质粒转化至大肠杆菌细胞中，通过抗生素筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。

4.5验证重组质粒：通过PCR和DNA测序等方法验证重组质粒是否正确插入目的基因。

5.实验结果通过本实验，我们成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并成功导入大肠杆菌细胞中。

通过荧光显微镜观察，发现大肠杆菌细胞发出绿色荧光，表明目的基因已正确表达。

6.结果分析通过本实验结果，我们可以得出以下结论：首先，本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒；其次，通过荧光显微镜观察到目的基因已在大肠杆菌细胞中表达出绿色荧光蛋白；最后，本实验为后续的生物荧光成像等应用提供了支持。

7.结论本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并在大肠杆菌细胞中实现了目的基因的高效表达。

该实验结果为后续的生物荧光成像等应用提供了有力支持，具有重要价值。

第1篇一、实验目的1. 了解荧光蛋白的基本原理和应用。

2. 掌握荧光蛋白表达、纯化和检测的方法。

3. 分析荧光蛋白在不同条件下的表达水平。

4. 探讨荧光蛋白在细胞生物学研究中的应用。

二、实验原理荧光蛋白是一种在特定条件下发出荧光的蛋白质，广泛应用于生物化学、细胞生物学和分子生物学等领域。

荧光蛋白的发光机制是：当蛋白质分子吸收特定波长的光子后，其电子从基态跃迁到激发态，然后以发射光子的形式释放能量，产生荧光。

三、实验材料1. 荧光蛋白基因（如绿色荧光蛋白GFP）2. 表达载体（如pET28a）3. E. coli感受态细胞4. DNA重组克隆试剂盒5. 转化试剂盒6. 限制性内切酶7. 连接酶8. 蛋白质纯化试剂盒9. 荧光显微镜10. 激光共聚焦显微镜四、实验方法1. 荧光蛋白基因克隆（1）设计引物：根据荧光蛋白基因序列设计一对引物，用于扩增目的基因。

（2）PCR扩增：以荧光蛋白基因作为模板，进行PCR扩增。

（3）克隆：将扩增得到的荧光蛋白基因克隆到表达载体上。

2. 荧光蛋白表达（1）转化：将重组质粒转化到E. coli感受态细胞中。

（2）诱导表达：在适当的温度和IPTG浓度下诱导荧光蛋白表达。

（3）收集菌体：离心收集表达荧光蛋白的菌体。

3. 荧光蛋白纯化（1）超声破碎：将收集到的菌体进行超声破碎。

（2）亲和层析：利用荧光蛋白与亲和树脂的结合特性，进行亲和层析纯化。

（3）洗脱和收集：用适当的洗脱液洗脱纯化的荧光蛋白，收集洗脱液。

4. 荧光蛋白检测（1）紫外-可见光谱：检测纯化荧光蛋白的浓度和纯度。

（2）荧光光谱：检测纯化荧光蛋白的激发光谱和发射光谱。

（3）荧光显微镜：观察荧光蛋白在细胞中的表达和定位。

5. 荧光蛋白应用（1）细胞培养：将荧光蛋白表达载体转染到细胞中，观察荧光蛋白在细胞中的表达和定位。

（2）共聚焦显微镜：利用激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白在细胞中的动态变化。

五、实验结果与分析1. 荧光蛋白基因克隆成功克隆了荧光蛋白基因，并在载体上得到表达。

分⼦⽣物学实验报告分⼦⽣物学实验报告----绿⾊荧光蛋⽩(GFP)基因的克隆、表达和纯化⼀、实验背景绿⾊荧光蛋⽩（green fluorescent protein，GFP）是⼀类存在于包括⽔母、⽔螅和珊瑚等腔肠动物体内的⽣物发光蛋⽩。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿⾊荧光。

它产⽣荧光⽆需底物或辅因⼦发⾊团是其蛋⽩质⼀级序列固有的。

GFP由3个外显⼦组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋⽩，相对分⼦质量为27.0 kMr，其蛋⽩性质⼗分稳定，能耐受60℃处理。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。

发⾊团是由其蛋⽩质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly⾃⾝环化和氧化形成。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。

实验使⽤的EGFP蛋⽩取⾃原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋⽩质编码序列。

此质粒原本被设计于在原核系统中进⾏扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进⾏表达。

本质粒主要包括位于PCMV真核启动⼦与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP 编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；⼀个由SV40 早期启动⼦启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动⼦可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。

在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。

EGFP蛋白纯化实验报告实验准备：蛋白纯化液：50mM HEPES+150mM Nacl+1mM DTT(PH: 7.6，分装250ml为不含EDTA的纯化液，余下750ml加入0.12g EDTA，标记为含EDTA的蛋白纯化液，4°冰箱保存)。

DNA酶Ⅰ:0.5mg/ml；（以前是片剂，现在使用时是1ul溶于100ul 纯化水中，-20°保存）。

溶菌酶E：10 mg/ml；（粉剂称重，溶于水后-20°分装保存）。

蛋白酶抑制剂：一片溶入2ml的纯化水中，-20°分装保存。

IGEPAL CA630：先配置1%的CA630（1ml水+10微升CA630，一周内有效）。

实验过程：取出四个结构域的菌体（各100ml菌量，实际达不到100ml，约90ml，因为50ml离心管装满过夜诱导的菌体离心的时候会溢出），置于冰上稍微化开后加入15ml不含EDTA的蛋白纯化液，10微升DNA 酶Ⅰ，10微升溶菌酶E，100微升蛋白酶抑制剂和75微升IGEPAL CA630，涡流混匀后4度冰箱旋转30分钟；超声：超声20秒后停59秒，85%的AMPL，共超声9-12次（在这个时间内都能做出来结果，个人经验，可溶性比较好的，比如igfbp 和Tsp结构域，超声9次就能得到比较浓的蛋白，vwfc和ctck结构域由于含有半胱氨酸比较多，丁老师之前摸索过vwfc的蛋白纯化，超声12次也能得到比较浓的蛋白条带，wb也得到验证，对于ctck结构域，超声12次就可以了，个人感觉ctck可能含有的半胱氨酸的含量比vwfc还要多，超声再多，没有用）；室温旋转床摇30分钟；离心，12000g*30min，取上清（取100微升标记为S用于电泳）；离心的时候取HaloLink树脂，每个结构域各1mlHalo悬液，用含有EDTA的蛋白纯化液洗涤，共洗涤3次，离心条件为1000g*5min;将树脂加入上清S中，室温旋转床充分结合1小时；过柱：依靠重力缓慢滤过，得滤液（FT），取100微升电泳；洗涤：20ml含有EDTA的纯化液洗涤树脂，每次10min，摸索过500mM高盐纯化液洗涤杂蛋白的方案，也摸索过用0.05%CA630或者0.05% 吐温-20去除杂蛋白的方案，效果都不理想；加入TEV酶10ul剪切，4度摇床反应过夜（TEV酶10ul足够，张老师一天做完的时候加入2.5ul也能打到很好的效果）；第二天：用15ml离心管接过滤液，得E1,取50微升电泳，剩余的加入10ul Hislink树脂，室温摇床反应15min，再1000g*5min离心，得E2，取100微升用于电泳。

分子生物学实验报告阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。

绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。

现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。

GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。

关键字：绿色荧光蛋白阿拉伯糖操纵子前言由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。

由海肾（sea pansy）所得的绿色荧光蛋白，仅有在498nm 有一个较高的激发峰点。

在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene）。

一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。

2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。

实验目的1.学习用诱导物诱导外源基因的表达。

2.学习感受态细胞的制备和转化。

实验材料、试剂及仪器实验材料GFP质粒DNA、感受态大肠杆菌实验试剂实验仪器恒温摇床、无菌操作台（含酒精灯.）、紫外灯、灭菌锅、电泳仪、1.5ml 离心管、培养皿、PCR扩增仪、台式离心机、紫外分析仪恒温水浴、冷冻离心机、平衡天平、微量移液器等实验步骤<一>GFP质粒DNA的提取与P38质粒提取方法相同。

GFP蛋白的诱导表达实验心得
要拍照植物GFP表达的位置，首先要有一台单反相机，安装植物拍照滤镜，路径和镜头要是对应的，如果不对应可在市场上购买滤镜安装转换卡，用荧光蛋白观察镜照射植物，用装有滤镜的单反相机直接拍照就行了，切记要关闭照相机闪光功能。

便携式荧光蛋白观察镜可采用内置有充电电池式，即开即用，可以直接带入到试验田里面观察，无需采摘叶片，如果试验田光线太亮，需要做隔光处理。

这几个波段都能激发GFP和EGFP出现荧光，365nm激发的比较弱，488nm激发的荧光最强，但488nm的激发波长太接近发射波长520nm，激发光和发射光距离太近对观察眼镜要求太高，观察眼镜很难把发射光隔离掉，会严重干扰发射的荧光。

所以用450nm的蓝光激发光是最理想的。

经过这次的实验,我个人得到了不少的收获,一方面加深了我对课本理论的认识,另一方面也提高了实验操作能力。

现在我总结了以下的体会和经验。

这次的实验跟我们以前做的实验不同,因为我觉得这次我是真真正正的自己亲自去完成。

所以是我觉得这次实验宝贵,深刻的。

单元四重组表达GFP蛋白的分离纯化及检测生物技术唐浩能13335155一、金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质GFP1.实验目的1)学习亲和层析的原理。

2)掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。

2.实验原理以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。

蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。

已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。

过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。

在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。

金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

本实验用IPTG诱导表达的蛋白质GFPuv是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。

3.材料、试剂材料：重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。

Ni 2＋chelating Sepharose Fast Flow 填料及层析柱试剂：1、超声和平衡缓冲液：50mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH7.0 500mL2、洗脱液I：50mM咪唑, 50mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH7.0，75mL3、洗脱液II：300mM咪唑(MW68.08), 50mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH7.0，50mL4、0.2M NiSO4(MW:265.85)溶液50ml5、0.05M EDTA, 0.5M NaCl 溶液100ml6、1M NaOH溶液100ml7、20％乙醇溶液仪器：紫外检测仪、蠕动泵、电脑显示系统4.实验步骤①亲和层析柱的填装（装柱）把层析柱固定在铁支架上，上端的柱头拧下，柱下端出口封闭。

一、实验目的1.了解绿色荧光蛋白和共聚焦扫描显微镜在细胞分子生物学中的应用2.学会使用质膜蛋白的分析软件。

二、带GFP的质膜蛋白分选概述1．质膜蛋白的跨膜信号在粗面内质网上合成的蛋白质有两类：分泌蛋白和膜蛋白，分泌蛋白在内质网上合成之后通过多种信号切除后释放到内质网的腔中，进行下游途径的转运。

膜蛋白较为复杂，它要靠疏水区滞留在内质网膜上。

下面以酵母二价铁的转运蛋白（IRT）为例来说明膜蛋白的转运。

IRT除了含有信号肽（也称开始转移序列‘start transfer sequence’是引导和启动肽链穿过内质网膜的信号肽)以外，还有八个跨膜结构域，这里有一个定向问题，即羧基端和氨基端位于内质网的内侧还是外侧问题。

经TMpred和TMHMM预测的IRT的跨膜螺旋结构域，发现它的羧基端和氨基端均位于质膜的外侧。

这样推测IRT在粗面内质网共翻译和转运时，羧基端和氨基端均位于内质网的内侧。

推测IRT除了开始转移序列外，还有四个内部起始转移信号（internal signal sequence）启动多肽链的转移和四个终止转移序列(stope transfer sequence)。

终止转移序列可能有某些序列与内质网膜有很强的亲和力，紧密结合在膜脂双层中而不再转入内质网腔中。

内部起始序列和终止转移序列都不被切除，整个多肽链作为穿膜八次的跨膜蛋白定位在膜中。

总结如下①一种多肽只有N端信号肽序列（或称开始转移序列）, 无停止序列T此蛋白合成后进入内质网腔中；②多肽的内部起始序列和终止转移序列位于分子中部，而且不被切除T 跨膜蛋白；③含多个内部起始序列和多个终止转移序列T多次跨膜的膜蛋白。

2．GFP的特性绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是一种能够自身催化形成发色结构，并在蓝光或紫外光的激发下发出荧光的新型报告基因。

GFP的发现及其研究迅速发展，使人们能够在正常生活条件下对活细胞内分子水平上进行的各种过程及其分子机理进行观察和研究。

gfp+细胞核的亲和免疫沉淀
摘要：
一、实验背景
二、实验方法
1.细胞培养
2.免疫沉淀
3.GFP+细胞核的亲和免疫沉淀
4.结果分析
三、实验结果
1.沉淀物中GFP+细胞核的检测
2.沉淀物中GFP+细胞核的功能分析
四、实验意义及展望
正文：
一、实验背景
绿色荧光蛋白(GFP)作为一种广泛应用的荧光标记蛋白，在生物学研究中具有重要意义。

通过将GFP与细胞核蛋白结合，可以实现对细胞核的实时观察。

为了更好地研究细胞核的生物学功能，研究人员设计了一种名为GFP+细胞核的亲和免疫沉淀的实验方法。

二、实验方法
1.细胞培养：首先，将细胞进行培养，使其达到一定数量。

2.免疫沉淀：使用相应的抗体对细胞进行免疫沉淀处理，使GFP+细胞核
与其他细胞组分分离。

3.GFP+细胞核的亲和免疫沉淀：将免疫沉淀后的细胞核进行进一步处理，通过亲和免疫沉淀技术，得到GFP+细胞核沉淀物。

4.结果分析：对沉淀物进行检测和功能分析，探讨GFP+细胞核在细胞中的作用及机制。

三、实验结果
1.沉淀物中GFP+细胞核的检测：实验结果显示，免疫沉淀处理后的细胞核中，GFP的表达明显上升。

经过进一步的亲和免疫沉淀处理，沉淀物中GFP+细胞核的数量显著增加。

2.沉淀物中GFP+细胞核的功能分析：通过对沉淀物中GFP+细胞核进行功能分析，发现其与细胞周期调控、基因表达和DNA修复等生物学过程密切相关。

四、实验意义及展望
本实验成功地实现了GFP+细胞核的亲和免疫沉淀，为进一步研究细胞核的生物学功能提供了有力工具。

实验目的通过对GFP蛋白表达基因的突变，使其表达性状发生变化，使其不能正常表达出产生绿色荧光。

进而熟练掌握基因定向突变的一系列流程。

实验原理利用PCR介导的定点突变来使DNA链上碱基突变，进而控制转录翻译与GFP绿色荧光蛋白的表达，使其不能发出正常的荧光。

问题的关键在于突变基因的获得，在PCR介导的定点突变中需要4种扩增引物(两对引物)，进行3次PCR反应，头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变内侧引物（本实验为针对AAG的TT A突变），扩增形成两条有一段可彼此重叠的双链DNA片段，通过电泳来去除未掺入的多余引物之后这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3,凹末端的异源双链DNA分子。

在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子，这样便产生了突变DNA分子。

实验流程：1.1.DH5α（GFP）提取质粒→检测→酶切（Ecol1，BamH1）→回收（载体，GFP）→检测1.2.GFP片段→第一轮PCR（引物1和突变引物2，引物2和突变引物1）→检验回收→第二轮PCR（前两次PCR产物混合作为模板）→回收检测→酶切→回收→电泳检测1.3.第二轮PCR回收产物与载体连接→感受态细胞转化（BL21）→筛选：→提取质粒→鉴定→诱导表达1.4.PAGE电泳检测→测序2 实验方法2.1DH5α质粒的提取：在60mL LB培养基中添加30μL卡拉霉素和10μL保藏的含有DH5α的E.coli的菌液，在37℃的摇床上过夜培养。

取1.5mL含有DH5α的E.coli的菌液，于Ep管中，12000prm/min,离心1min，去掉上清液，收集菌体。

加100u1溶液I振荡使菌体充分悬浮，冰浴5min，加200ul新配制的溶液II轻轻摇匀冰浴10min，加150ul溶液III，摇匀冰浴5min 然后12000rpm,离心5min,将上清移入另个Ep管中。

加等体积的酚:氯仿=1：1抽提一次，移出的水相中加入2倍体积的无水乙醇混匀-20℃放置15min, 12000rpm离心l5min, 沉淀用70%的乙醇洗一次，再离心，沉淀干燥后溶于20ul TE，4℃保存。