蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理

实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。

溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。

调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。

反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。

分装、包扎、灭菌。

霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。

分装、包扎、灭菌。

产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。

pH7．0。

配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。

选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。

固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。

筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。

1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。

蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。

蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。

2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。

b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。

常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。

也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。

c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。

通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。

3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。

b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。

c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。

4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。

b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。

5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。

b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。

c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。

这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。

根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。

在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。

一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建是一个涉及微生物学、生物化学和分子生物学等多个领域的综合性实验。

以下是该实验的详细步骤：一、蛋白酶产生菌的鉴定1.观察菌落的形态和颜色：将待鉴定菌株接种在固体培养基上，观察菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等特征。

与已知蛋白酶产生菌的菌落特征进行比较，初步判断待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

2.显微镜观察：将待鉴定菌株进行显微镜观察，观察其细胞形态、大小、排列方式等特征。

与已知蛋白酶产生菌的显微镜特征进行比较，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

3.生理生化实验：进行一系列的生理生化实验，包括碳源利用实验、氮源利用实验、生长曲线测定、氧化还原实验等，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌，并对其生长特性和代谢特性进行研究。

4.分子生物学鉴定：提取待鉴定菌株的基因组DNA，进行PCR扩增和序列分析，与已知蛋白酶产生菌的基因序列进行比对，确定待鉴定菌株的分类地位和系统发育关系。

二、蛋白酶性质研究1.蛋白酶的分离纯化：从待鉴定菌株中提取蛋白酶，通过离子交换层析、凝胶过滤等手段进行分离纯化。

2.酶活性检测：设置合适的底物浓度和反应条件，测定蛋白酶的活性，包括最适pH、最适温度、动力学常数等。

3.酶稳定性研究：在不同温度、pH等条件下，检测蛋白酶的稳定性，确定其应用范围和使用条件。

4.底物特异性分析：通过蛋白质印迹实验、底物特异性分析等方法，研究蛋白酶的底物特异性，为其应用提供依据。

三、表达载体构建1.目的基因获取：通过PCR扩增或基因组测序等方法，获取蛋白酶基因。

2.载体选择：根据目的基因的特点和应用需求，选择合适的表达载体，如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。

3.载体构建：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

可以采用DNA重组技术、定向进化技术等方法，对目的基因进行改造和优化。

4.转化宿主细胞：将重组表达载体转入合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫细胞等。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着全球气候变化和人类活动的影响，盐碱化和荒漠化的问题日益严重。

盐碱土壤中的高盐浓度不但对植物生长带来影响，也对微生物生长带来极大的压力。

而在这样的环境中，若能筛选出一些耐盐菌株，对维护土壤生态平衡和提高农业生产力都有着积极的意义。

本研究采用土壤样品培养菌株与测序分析相结合的方法，筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和评价。

1、筛选菌株从渭南市半夏沟盐碱土壤中挖取样品，使用平板法选取耐盐菌。

筛选条件为：15%NaCl、pH=8.0、温度为37°C。

经过3个孔眼培养基的筛选后，获得了一株能够在高盐高碱环境下生长的菌株。

2、16S rRNA测序分析使用菌落PCR方法提取该菌株的基因组DNA，将其16S rDNA片段扩增并纯化，测序结果表明该菌株属于葡萄球菌属。

经过BLAST比对分析，其与NCBI数据库中的Staphylococcus arlettae的同源性可达到99.67%。

3、蛋白酶高产能力评价培养该菌株于含有1.5%NaCl的LB培养基中，经过48小时后采集细胞沉淀并测定其蛋白酶活性水平。

结果表明，该菌株可产生100U/mL的蛋白酶活性，具有良好的蛋白酶高产能力。

4、耐盐性评价在不同浓度的NaCl中对该菌株进行耐盐性评价。

结果表明该菌株最大耐盐浓度为18%NaCl，具有较强的耐盐能力。

5、蛋白酶酶学性质研究将该菌株的蛋白酶纯化并研究其酶学性质。

结果表明，该蛋白酶在pH=9.0~10.0和温度为50℃时具有最高酶活性，属于碱性蛋白酶。

综合上述结果可知，本研究筛选出一株具有较强耐盐能力和蛋白酶高产能力的Staphylococcus arlettae，对于盐碱土壤的改良和农业生产都具有重要的潜在应用前景。

安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2017，23（21）浓香型高温酒曲中蛋白酶产生菌的筛选与鉴定黄家驷1刘盾1陈玄阳1王珊珊1陈燕1程爽1，2*（1南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004；2河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南，河南南阳473004）摘要：该研究利用酪蛋白选择性培养基从浓香型高温酒曲中分离得到1株有明显水解圈的蛋白酶产生菌LS-1，经16SrDNA鉴定其为地衣芽孢杆菌；LS-1通过发酵培养提取出粗酶液，其酶活为180U/mL。

关键词：酒曲；蛋白酶；筛选；鉴定中图分类号Q93-31文献标识码A文章编号1007-7731（2017）21-0029-03Isolation and Identification of Protease-producing Srains from Luzhou-flavor Liquor Starter Huang Jiasi1et al.（1School of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang473004，China）Abstract：A protease-producing strain was isolated from Luzhou-flavor Liquor Starter with casein-selective medi⁃um，named LS-1.The16SrDNA was amplified by PCR and the amplification products was subjected to sequencing and homology analysis.As a result，strain LS-1was identified as Bacillus licheniformis.The protease activity in fer⁃mentation broth was180U/mL.Key words：Liquor Starter；Protease；Isolation；Identification白酒是我国传统的发酵食品，有着悠久的历史，从古至今一直受到人们的喜欢。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定
盐渍化是困扰全球农业持续发展的问题之一。

在高盐环境下，微生物为了适应环境，
往往会产生一些耐盐酶，这些酶具有广泛的应用前景，目前对这类酶的研究越来越受到关注。

本研究通过对芽孢杆菌菌株进行耐盐蛋白酶的筛选及鉴定，旨在找到一株高产耐盐蛋
白酶的菌株，为该类酶的产业化应用提供基础资料。

研究中使用了来自不同环境中的细菌菌株作为研究对象，经过耐盐筛选和试验验证，
筛选出一株产酶菌株。

该菌株的形态特征和生化特性表明，它属于芽孢杆菌属。

为了进一步了解筛选出的菌株的耐盐蛋白酶的生化特性，对该菌株产酶条件的影响进
行了初步研究。

结果表明，最佳的产酶条件为温度37℃，pH值为8.0，盐度为12%。

在此
条件下，该菌株耐盐蛋白酶的相对酶活达到了最高值。

此外，研究还分别分析了该菌株产酶过程中酶活力与时间、碳源和氮源等因素的关系，并对其酶解产物进行了初步的质谱分析。

结果表明，该菌株的耐盐蛋白酶主要是以胶原蛋
白为底物，可将胶原蛋白降解成小分子多肽和氨基酸。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着全球环境的变化以及产业的不断发展，盐碱化土地的面积不断扩大，海洋水质的污染也越来越严重，导致许多微生物栖息环境的盐度浓度逐渐增加。

在这种背景下，具有耐盐特性的微生物资源逐渐备受关注，因为高盐环境是其适宜生长的环境，因此具有耐盐能力的生物对于生物制药、食品加工、工业废水处理等领域具有非常重要的应用价值。

其中，耐盐蛋白酶在生物技术领域有着重要的应用，在酶工程、制药、食品加工、皮革加工等方面具有广泛应用前景。

一般来说，耐盐蛋白酶的产生需要在高盐度的环境中进行培养，因此筛选高产耐盐蛋白酶的菌株和生产技术非常重要。

在本次研究中，我们使用了土样和海水样品进行菌株筛选，主要通过营养琼脂平板和液体培养基筛选获得。

在培养基中添加NaCl和其他盐类，以及蛋白质为碳源，使得耐盐菌能够在高盐浓度下生长、形成菌落并产生蛋白酶。

经过初步的筛选，我们通过对菌落形态、色素、生长速度等外在特征进行观察，从中挑选出了一株耐盐蛋白酶高产的菌株。

接下来，我们对这株菌株进行了初步的鉴定。

首先，我们对菌株的形态和结构进行了测定和分析。

通过显微镜和染色技术，我们观察到该菌株为无色单杆菌，形态规则，长约2~3μm，宽约0.5~1μm。

然后，我们对其生理生化特性进行分析。

该菌株具有产酸能力，无能产氧化酶，无需氧生长，依赖碳酸盐共存进行生长等特性。

接着，我们对其分子生物学特性进行了测定。

通过菌株的16S rRNA序列分析，我们鉴定出该菌株属于嗜盐菌属(Halomonas)，与Halomonas penaei的相似性为98%。

最后，我们通过蛋白酶活性测定，发现该菌株产生的蛋白酶活性较高，达到了100U/mL。

综上，我们成功地筛选出了一株耐盐蛋白酶高产菌株，并通过初步的形态、生理、生化、分子生物学特性的鉴定，确定了该菌株的分类学位置和蛋白酶产生能力。

该菌株的筛选和鉴定为耐盐蛋白酶的高效生产奠定了基础。

在未来，转基因技术、酶工程等手段的运用有助于进一步提高该菌株产酶能力，使其在实际应用中发挥更大的作用。

一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件-信息化建设中心-广东轻工一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。

采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。

通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。

通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。

在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。

关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIEGui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate ofprotein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimalcondition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition *基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2021B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ202107），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ202103）。

微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。

由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。

尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。

因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。

材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。

采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。

取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。

后选取筛选菌落接种于琼脂板上。

菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。

然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。

菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。

在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。

选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。

菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。

结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。

本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。

陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。

并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。