第10卷第4期2012年7月生物加工过程Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol．10No．4Jul．2012doi ：10．3969/j．issn．1672－3678．2012．04．004收稿日期：2011－05－03基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目（2009CB724702）；南京工业大学学科基金资助项目（39708010）作者简介：高浩峰（1986—），男，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：微藻生物技术；李环（联系人），女，副教授，E-mail ：lihuan45678@163．com 半连续及连续培养小球藻减排沼液及CO 2高浩峰，李环，韦萍（南京工业大学生物与制药工程学院，南京210009）摘要：采用半连续或连续模式培养小球藻，考察小球藻减排沼液和CO 2的能力。
结果表明：在半连续培养模式中，当更新率为30%时，沼液中的N 、P 质量浓度可分别稳定在16 18和0．4 0．6mg /L ，达到污水二级排放标准；提高更新率到40%以上，3d 后微藻生物量及其对沼液中N 、P 的吸收达到动态平衡，但N 、P 去除率未达到污水直接排放标准；在连续培养模式中，分别选用20%及30%的日更新率，7L 规模12d 后沼液中的总氮（TN ）仍高达55.64mg /L 。
说明大规模培养条件下的光限制是微藻法减排沼液的主要制约因素。
关键词：沼液；普通小球藻；培养模式；氮；磷；去除中图分类号：Q55文献标志码：A文章编号：1672－3678（2012）04－0016－05Reduction of biogas slurry and CO 2by Chlorella vulgarisin semi-continuous and continuous culturesGAO Haofeng ，LI Huan ，WEI Ping（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering ，Nanjing University of Technology ，Nanjing 210009，China ）Abstract ：Chlorella vulgaris was cultivated by semi-continuous and continuous mode to reduce the emis-sions of both biogas slurry and CO 2．In semi-continuous cultivation mode ，when the renewal rate was 30%，nitrogen and phosphorus contents in the biogas slurry were stable at 16to 18mg /L and 0.4to 0.6mg /L ，respectively ，which met the secondary sewage discharge regulations．While the renewal rate in-creased to higher than 40%，a dynamic equilibrium was obtained between the microalgae biomass and its absorption of nitrogen and phosphorus in the biogas slurry after three days ，but the removal rates of nitro-gen and phosphorus did not meet the direct sewage discharge standard．Effects of chlorella vulgaris on the removal of nitrogen and phosphorus in the biogas slurry were investigated in a columnar photobioreactor by selecting the daily renewal rates at 20%and 30%in continuous mode．The results exhibited that the total nitrogen amount in the biogas slurry remained at 55．64mg /L after 12days on the 7L scale．Emission re-duction of biogas slurry employing the microalgae method was primarily restricted by the light limitation during the large-scale cultivation．Key words ：biogas slurry ；Chlosella．vulgaris ；culture mode ；nitrogen ；phosphorus ；removal 随着工业的发展和人口的增加，CO 2浓度持续升高，温室效应日益严重，地球气候变暖的问题已成为当代科学界研究的重大课题［1］。
微藻具有生长迅速、易于培养等优点，同时微藻能固定CO 2，因此微藻法生物固碳亦成为国内外研究的重要方向之一［2－4］。
沼气发酵过程可去除原料中大量的可溶性有机物，但是发酵废液（沼液）中仍残存高浓度的N、P 等营养物质。
因此沼液的直接排放会造成水体污染，而沼液中的N、P及无机盐恰好是普通小球藻（Chlorella vulgaris）的优质肥料。
若利用小球藻来减排沼液不但能解决沼液排放所导致的环境问题，还能有效固定空气中CO2，并以藻细胞生物质能的形式被重新利用，从而达到对废弃物资源化再利用的目的，具有显著的环境效益和经济效益［5－7］。
王钦琪等［8］研究发现，当混合气体中CO2体积分数为10%时，对N、P的去除效果最佳；但批次培养周期约14d后，小球藻对沼液的处理量太小，远远不能满足普通沼气站对沼液排放的需求。
半连续培养和连续培养可有效扩大沼液处理量，且沼液的更新可及时降低藻细胞的密度进而解除光限制，再输入N、P等营养物质，为藻细胞提供良好且稳定的生长环境，这样可使小球藻长期处于对数生长期，从而提高小球藻处理沼液和固定CO2的能力［9－13］。
笔者在前期研究的基础上，扩大沼液减排规模到3.5及7L，考察半连续模式和连续培养模式下的小球藻减排沼液及CO2的能力，以期对沼液的生态法处理及微藻的低成本培养提供一定的实际应用价值。
1材料与方法1．1藻种保藏实验藻种为普通小球藻（Chlorella vulgaris），由暨南大学张成武教授提供。
液体保藏培养基为BG11培养基（g/L）：NaNO3 1.5，MgSO4·7H2O0.075，K2HPO4·3H2O0.04，Na2CO3 0.02，CaCl2·2H2O0.036，柠檬酸0.006，柠檬酸铁0.006，2Na·EDTA0.001；微量元素（mg/L）：H3BO3 0.061，CuSO4·5H2O0.0025，MnSO4·H2O0.169，ZnSO4·7H2O0.287，钼酸铵0.0125）。
在液体培养基加入2%的琼脂制得平板保藏培养基。
藻种保存方式为平板4ħ冰箱放置保种和液体室温弱光静置保种（每天摇2 3次）。
1．2沼液培养基采用南京工业大学国家生化中心沼气发酵后的沼液为小球藻培养的基础培养基。
沼液经过沉降池去除较大的固体颗粒后，再经过板框压滤机过滤去除较小的颗粒，液体部分储存在废液池中备用。
分别采用碱性K2S2O8消解紫外分光光度法、钼酸铵分光光度法、等离子发射光谱法测定沼液中的总氮（TN）、总磷（TP）和金属离子浓度［14－18］，结果见表1。
由表1可知，沼液含有小球藻生长所需的基本营养成分，即可以利用微藻细胞来富集吸收沼液中的各种营养成分，从而达到沼液减排的目的。
表1沼液中N、P及金属离子质量浓度Table1Contents of nitrogen，phosphorus and metal ions in biogas slurry 元素TN TP K+Ca2+Fe3+Mg2+Mn2+Cu2+Zn2+Hg2+Pb2+ρ/（mg·L－1）279．3731．41475．8160．021．044100．941．1620．0560．0860．1920．1281．3小球藻的培养以日光灯为光照光源，光照强度为6000lux，光照光暗时间比为18ʒ6，培养温度为25 28ħ。
将小球藻藻种接种到纯沼液中，初始接种量OD680值在1．0左右，通入混合空气培养，每天取样对微藻生物量及沼液中的N、P含量进行测量。
半连续培养：小球藻培养一段时间后，当沼液中N、P量分别低于20和1mg/L，达到二级污水排放标准时，以一定的更新率对光反应器中的沼液进行更换。
连续培养：小球藻培养一段时间后，当沼液中N、P量分别低于20和1mg/L时，用恒速流动泵以一定的速率从光反应器中放出沼液，用另一个恒速流动泵以相同的速率向反应器中加入新的沼液。
更新率是指更新培养基占总培养基的百分比。
在半连续培养模式中，当微藻的培养条件和营养条件一定时，特定藻株的最适更新率是一定的。
更新率的增加，会使藻细胞的浓度下降，光衰减变小［12］；反之，更新率降低，光衰减变大，透过培养液的光强会减弱，同时会造成藻细胞生长所需的营养不足，严重影响生物量的积累，从而影响藻细胞的产率。
因此，更新率作为半连续培养模式中的重要参数之一，对微藻的生71第4期高浩峰等：半连续及连续培养小球藻减排沼液及CO2长和细胞内生化组分都有重要的影响。
1．4生物量的测定用光密度法来测定生物量。
680nm处的光吸收值间接表示。
取1mL小球藻培养液，将藻液稀释至OD680在0.2 0.8之间，测定其在680nm下的光吸收值。
在半连续培养模式中，在每次沼液更新前取藻液，测其生物量。
1．5CO2去除率的测定方法向光生物反应器底部通入CO2和空气的混合气体，取2个气体取样袋分别收集通入光生物反应器的混合气体和经小球藻培养后的气体，利用CO2红外气体分析仪分别测量2个取样袋中气体的CO2浓度。
根据通气流量和通入气体与流出气体的CO2浓度变化计算小球藻对CO2的去除率和去除量。
1．6微藻采收量、生长率及产率的计算采收量γ=VXρ（1）式中：V为光生物反应器的装液量（mL）；X为更新率（%）；ρ为每日微藻培养基更新前的藻质量浓度（g/L）。
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