外源基因在大肠杆菌中的表达解析

导物可以使启动子Plac介 导的转录大幅提高。
P
基底水平转录 阻遏蛋白
O 诱导
高效转录 O
启动子 启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有代谢 激活因子（CAP）结合区，小 分子cAMP激活CAP，CAP结 启动子控制区，进而促进Plac介 导的转录。葡萄糖代谢使cAMP 减少，也能阻遏Plac介导的基因 转录。因此，基因工程中使用 的乳糖启动子均为抗葡萄糖代 谢阻遏的突变型，即Plac UV5。
色氨酸 阻遏蛋白
基底水平转录
Ptrp 除去色氨酸
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA）
高效转录
Ptrp
Otrp
高效转录
Ptrp
Otrp
启动子 启动子的可控性
l 噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻
遏，很难直接诱导控制。在基因
Ptrp
工程中常使用温度敏感型的cI突
变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋
5 外源基因在大肠杆菌中的表达
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子 启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
启动子 启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
重组DNA技术与基因工程
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 2 重组DNA技术所需的基本条件 3 重组DNA技术的操作过程 4 目的基因的克隆与基因文库的构建 5 外源基因在大肠杆菌中的表达 6 外源基因在酵母中的表达
5 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
-10 区序列
GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
启动子 启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区 Olac偶联在一起，在没有 诱导物存在时，操纵子 处于基底水平表达；诱
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷Байду номын сангаасIPTG）
白在42℃时失活脱落，PL便介导
目的基因的表达。但在大型细菌
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp
此常使用一个双质粒控制系统，
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达 B
终止子 强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
ori
基因组DNA中克隆筛选。
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆 菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差 别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构 序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS），大约涉及30个碱基的长
cAMP CAP
高效转录
Plac 葡萄糖代谢
O cAMP浓度降低
基底水平转录
Plac
O
高效转录
Plac UV5 O
启动子 启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达。
Apr ori
pKO1
终止密码子 galK
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子 启动子的构建
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率。
度
核糖体结合位点 核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游10个碱基内的序列 5’-UAAGGAGG 3’， 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中 的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将 mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始 位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’端若干密码子的碱基序列；
终止子 强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对
于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 Apr 构，以增强其转录终止作用。
Tcr pCP1
终止子也可以象启动子那样，通
过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
5 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素