报告正文
1. 立项依据与研究内容
（1）项目的立项依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）
微生物遗传学的一个基本问题是细菌如何维持和改变自身的基因组大小和结构以适应不断变化的外界环境[1-3]。已知细菌有多种机制来改变自身基因组大小，如基因丢失、基因水平转移、基因复制（Duplications）等等[4, 5]，因此细菌的基因组总是处于不断变化的状态。如Lukjancenko等人对已公布的61株大肠杆菌基因组序列进行分析[6]，发现仅有6%的基因存在于所有的菌株中，这些基因被称为核心基因（core genes）；而某些菌株中的重要基因却在另一些菌株中出现缺失。因此，细菌基因丢失（gene loss or genome reduction）也是细菌基因组进化中的重要过程之一，其动力和机制也是微生物遗传学的研究热点之一。
常见的基因丢失机制主要有两种：同源重组[7]和随机丢失[8, 9]。同源重组介导的片段丢失概率较高，但是必须具有一定的同源序列，如大肠杆菌RecA系统介导的同源重组要不少于25bp的同源片段[10]；猪链球菌中长度为89 kb的致病岛在整合酶介导下出现剪切和转移的概率约3.2×10-4，其两侧的同源序列长度为15 bp[11]。而随机丢失是所有生物DNA复制过程中都有可能出现的错误，由于细菌中存在多种基因组保护机制，如同源重组系统、非同源末端连接、错配修复等[12, 13]，因此，随机丢失的概率是很低的，如伤寒沙门菌出现DNA丢失的概率在0.5×10-9 ~ 2.2×10-8左右[1]。
本课题组于2014年报道了一种新的细菌耐受噬菌体现象：铜绿假单胞菌可丢失大片段基因组DNA从而耐受噬菌体的感染，我们曾将这种机制称为“断臂求生”[14]。以铜绿假单胞菌宿主菌PA1及其裂解性噬菌体PaP1为模型，分离鉴定耐受噬菌体的突变菌株PA1r，意外的是耐受菌株PA1r可以分泌红色色素（见“工作基础”图3）。于是我们对敏感株PA1和耐受菌PA1r进行了全基因组测序和比较基因组学分析，发现PA1r基因组中丢失了一段长219.6 kb的片段。其中hmgA基因的丢失，导致了一种红色底物尿黑酸的积累，而galU 基因的丢失则导致PA1r失去了脂多糖(LPS)。LPS是噬菌体PaP1感染宿主菌的受体，因此噬菌体无法吸附上PA1r（见“工作基础”图3）。而且，我们通过“彷徨试验”证实，基因组片段的丢失是出现在噬菌体感染之前的，也就是说噬菌体在这个过程中只是发挥了选
择作用，而不是诱导基因组片段的丢失。因此，我们证实细菌可通过丢失自身基因组片段从而耐受噬菌体。但是，铜绿假单胞菌大片段DNA丢失具有三个显著的特点：（1）基因组片段丢失的概率（即红色耐受菌出现的概率）非常高，达到（1.02±0.85）×10-6，显著高于正常细菌基因组片段丢失的概率（10-8~10-9）；（2）丢失的片段非常大，约200~300 kb；（3）片段断裂的位点不是特异的：虽然都包括了hmgA和galU两个基因，但是不同红色耐受菌中的断裂位点是不一致的（图1）。因此，“断臂求生”的机制不符合同源重组和随机丢失的特点，提示铜绿假单胞菌中大片段DNA的丢失可能是由一种新机制介导。
图1. PCR（A）和脉冲场电泳(B)证实4株红色耐受菌（PA1r、PA1R-37、PA1R-57、PA1R-61、）丢失的DNA
片段位点具有显著差异（约200~300 kb）。（C）：4株红色耐受菌基因组片段丢失的示意图。
我们推测：大片段DNA丢失的第一步是由某种DNA酶剪切导致DNA断裂，随后两个断点之间的DNA被连接酶连接，而中间的片段则出现丢失（图2）。因此，我们首先从铜绿假单胞菌中的DNA酶入手。如果此DNA酶缺失，铜绿假单胞菌则不能剪切DNA，则不会出现大片段DNA的丢失，也不能产生红色耐受菌。反过来，首先要寻找不能产生红色耐受菌的突变菌株，其缺失的基因可能就是剪切大片段DNA的酶。同时，为了便于今后的同行交流与合作，我们选择了铜绿假单胞菌国际标准株PAO1进行后续试验。裂解性噬菌体JG004的受体也是LPS[15]，而且PAO1被裂解性噬菌体JG004感染后，也会出现大片段DNA丢失而产生红色耐受菌，DNA丢失的片段大小和概率均与PA1一致。因此，我们从美国University of Washington Genome Center购买了铜绿假单胞菌PAO1的转座子突变文库[16]。根据PAO1的基因组注释结果，我们筛选了所有可能参与DNA剪切的酶（同源重组系统：
RecA、RecB、RecC、RecD；非同源末端修复系统(NHEJ）：LigD和Ku；错配修复系统（MMR）：MutS、MutL、UvrA/B/C、UvrD；其它推测的核酸酶：XthA、EndA、XseB、XseA、P A4172、P A4282；详见“工作基础”表1）。将相应的突变菌株分别感染裂解性噬菌体JG004后，鉴定不能产生红色耐受菌的转座子突变株，那么这个突变株缺失的基因可能就是介导“断臂求生”的关键基因。通过筛选，我们意外的发现：mutL突变后，PAO1ΔmutL没有再出现红色耐受菌（见“工作基础”），而其余筛选的转座子突变菌株均可以产生红色耐受菌，这一结果强烈提示MutL可能是导致DNA大片段丢失的关键酶！
MutL是错配修复系统中的关键酶，其功能在大肠杆菌这一模式生物中被深入研究[12, 13, 17]。在大肠杆菌中，MutS首先结合于点突变处，然后募集MutL并形成复合体，该复合体再激活核酸酶MutH，激活后的MutH可以识别未甲基化的GATC位点，并在错配位点处切割单链DNA。然后，核酸外切酶在解旋酶及单链结合蛋白SSB蛋白的协助下，将未甲基化的GATC至错配位点之间的整段单链DNA去除。随后，DNA聚合酶将以另一条DNA 链为模板进行DNA合成，从而消除错配位点，而且GATC位点可以与错配位点相隔1000 bp 以上。但是，这一剪切模式仅存在于部分变形菌门（proteobacteria）的细菌中，在其余细菌中，MutL兼具核酸酶的作用，因而没有MutH。铜绿假单胞菌中的MutL被证实具有错配修复功能[18, 19]，而且体外实验中发现其具有单链DNA剪切功能。然而，MutL是否具有双链DNA剪切功能还有争议。有报道称，在Mg2+、ATP存在的情况下，枯草芽胞杆菌的MutL（BsMutL）可以剪切单链DNA；而当加入Mn2+后，则可以剪切双链DNA，导致DNA 双链断裂[20]。但是，尚不清楚铜绿假单胞菌的MutL是否也具有双链DNA剪切功能。由于缺少直接在细菌中检测MutL剪切双链DNA的方法，因此目前还没有在细菌内证实MutL 剪切双链DNA的报道。
因此，我们提出一种假设：铜绿假单胞菌的MutL具有双链DNA剪切活性，在修复细菌DNA的点突变时，会有一定的概率在点突变的附近剪切双链DNA。随后，两个点突变被剪切后，两个DNA断端被连接酶重新连接起来，导致两个断端之间的DNA片段丢失。由于点突变是随机的，因此，这种剪切-重新连接是具有随机性的，筛选的红色耐受菌中大片段DNA丢失位点的非特异性也支持这一假设。只有当丢失的DNA片段同时包含有hmgA 和galU两个基因时，则具有了分泌红色色素和耐受噬菌体的双重特点，经过噬菌体感染可被识别筛选出来（图2）。
综上所述，本课题在发现铜绿假单胞菌可通过基因组大片段丢失从而耐受噬菌体感染的工作基础之上，筛选到MutL可能是介导染色体DNA大片段丢失的关键酶，将通过基因敲
