扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版)
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相关仪器的信息:
透射电镜:JEOL(公司) JEM-1230(型号)TEM,产地:日本
超薄切片机:Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome,产地:奥地利
扫描电镜:Philips XL30 ESEM,产地:捷克
临界点干燥仪:Hitachi HCP-2 Critical point dryer,产地:日本
真空喷镀仪:Eiko IB5 ion coater,产地:日本
包埋剂:SPI-CHEM Spurr resin,产地:USA
TEM样品包埋块制作有关注意事项
一、取材:
1、动作迅速:组织离体后,应将其快速放入固定液中,使组织细胞尽可能保持原来的生活状态;
2、减少损伤:选择锋利切割器械,减少牵拉或挤压组织;
3、组织块大小:一般要小于1mm3。
二、固定:固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞
的过程,目的是尽可能保持细胞的原有生活状态,不发生位移,减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面,应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中
2、使用锇酸的注意事项
I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液,使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂,必须在通风橱中操作,废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学,请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗:应彻底漂洗干净,减少固定液与固定液或与脱水剂之间的
反应。
四、脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包
埋剂大都是非水溶性树脂,只有将生物组织中的游离水清除干净,包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意:
I 逐级脱水而不能急剧脱水;
II更换溶液时动作要快,特别是不要让组织离开溶液,否则会在组织内外产生气泡;
III脱水过程中若要长时间停留或过夜,应放在70%脱水剂中,并在4℃保存。
五、渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂,使细胞内外
空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。
包埋剂配制及使用过程中的注意事项:
I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的;
II配制过程中应搅拌均匀,使用过程中应避免异物,特别是水、乙醇、
丙酮等混入包埋剂;
III配制好的包埋剂应密封保存,避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中,延长其使用期。
表1 戊二醛溶液的配制
表2 0.2M 磷酸缓冲液(PBS )的配制
按下表比例混合A 、B 液后,配成0.2mol/L 的母液,其中pH7.0为常用配方 pH 值 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
A 液 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7
B 液
92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30
在缓冲液中加入葡萄糖,蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。
表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制
表4 2%锇酸溶液的配制
A 液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液
B 液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 Na 2HPO 4 28.4g 或Na 2HPO 4.H 2O 31.61g 或Na 2HPO 4.2H 2O 35.6g 或Na 2HPO 4.7H 2O 53.63g 或Na 2HPO 4.12H 2O 71.64g
加双蒸水至1000mL
NaH 2PO 4 24.0g 或NaH 2PO 4.H 2O 27.6g 或NaH 2PO 4.2H 2O 31.21g
加双蒸水至1000mL
表5 Spurr包埋剂配方
注:通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚合反应的速度。
透射电镜样品制备程序:
No.1 包埋切片样品的制作过程
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜,然后按下列步骤处理样品:✧倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;
✧用1%的锇酸溶液固定样品1-2h;
✧倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;
✧用梯度浓度(包括50%,70%,80%,90%和95%五种浓度)的乙醇
溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用100%的乙醇处理一次,每次20min;最后过度到纯丙酮处理20min。
✧用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1/1)处理样品1h;
✧用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3/1)处理样品3h;
✧纯包埋剂处理样品过夜;
将经过渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜,即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片,获得70-90nm的切片,该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min,即可在日本JEOL 公司的JEM-1230型透射电镜中观察。
1).Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer.
2).Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to absolute acetone for 20 minutes. 3). Infiltration: The specimen was placed in 1:1 mixture of absolute acetone