芦荟、紫苏组织培养实验报告一、实验目的与实验要求1、学习MS培养基母液的配制方法。
2、学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。
3、初步掌握外植体芦荟、紫苏等植物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。
4、认识植物组织培养技术在生产实践中起的作用，尤其在于保存珍贵物种和生产研究方面的应用。
5、体验开放式实验教学，培养生物实验意识，提高学习的主动性、获取实验知识的能力和撰写实验报告水平。
二、实验方案1、实验仪器冰箱，分析天平，烧杯（50mL，100mL，500mL，1000mL），量筒(1000mL，100mL，25mL)，容量瓶(1000mL，500mL，100mL)，磨口试剂瓶(500mL，1000mL)，药勺、称量纸、精密pH试纸，滴管、玻璃棒、电炉，微波炉、移液管（10mL，5mL，2mL，1mL，0.5mL），吸耳球，滴瓶，锥形瓶、纱布，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，标签纸，记号笔、解剖工具、托盘、棉花、超净工作台2、实验药品NH4NO3, KNO3, CaCl2•2H2O, MgSO4•7H2O, KH2PO4, KI, H2BO3，MnSO4•4H2O,ZnSO4•7H2O, Na2•MoO4•2H2O, CuSO4•5H2O, CoCl2•6H2O, Na2•EDTA•2H2O，FeSO4•7H2O,烟酸,甘氨酸, 维生素B1,维生素B6 ,肌醇, 蒸馏水, 琼脂,蔗糖,NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH, 升汞,吐温-803、实验原理(1)母液法配制培养基原理在实验中常用的培养基，可将其中的各种成分配成10倍、100倍的母液，放入冰箱中保存，用时可按比例稀释。
配制母液有2点好处：一是可减少每次配制称量药品的麻烦，二是减少极微量药品在每次称量时造成的误差。
母液可以配单一化合物母液，但一般都配成以下四种不同混合母液。
应注意以下几个方面：A.药品称量应准确，尤其微量元素化合物应精确到0.0001克，大量元素可精确到0.01克。
B.配制母液的浓度适当，一是长时间保存后易沉淀，二是浓度大，用量少，在配制培养基时易影响精确度。
C.母液贮藏不宜过长，一般几个月左右，要定期检查，如出现浑浊、沉淀及霉菌等现象，就不能使用。
D.母液应放在2－4℃的冰箱中保存[1]。
(2)组织选材要求要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。
要选取植物组织内部无菌的材料。
这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。
另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。
因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。
培养材料要消毒。
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上[2]。
(3)灭菌原理常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类[3]，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。
环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。
在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。
灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）。
在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。
冷却后，立即使用。
操作中可采用250或500mL的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）。
干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。
由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续90min 来灭菌。
干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。
包扎可用耐高温的塑料。
灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。
烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。
干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
紫外线灭菌。
在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。
紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。
紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。
喷雾灭菌（物体表面）。
物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。
(4)初代培养植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。
而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。
此阶段培养物的不良及改进情况[4]a.培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯。
可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当。
改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。
b.培养物长期培养几乎无反应可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。
改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。
c.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。
改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。
d.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。
e.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。
改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。
(5)继代培养以植物的茎、叶等作为外植体进行离体培养，可以直接诱导器官分化，产生芽、根，形成新的植物体；也可以诱导其改变原来的分化状态脱分化形成愈伤组织。
这种愈伤组织在一定条件下，又能“再分化”出根和芽等器官。
在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控着培养细胞再生完整植株的不同方式。
此阶段培养物的不良表现及改进措施[4]a.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。
改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。
b.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。
改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。
c.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。
改进措施：减少生长素用量，适当降温。
d.叶粗厚变脆可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。
改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。
e.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。
改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。
f.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。
改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。
g.幼苗淡绿，部分失绿可能原因：无机盐含量不足，pH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。
改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好pH值，调控温度、光照。
h.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中可能原因：瓶内气体状况恶化，pH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。
改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。
(6)生根培养I此阶段培养物的不良表现及改进措施a.培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织[5]可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位勇气不良；生根程序不当；pH值不适，无机盐浓度及配比不当。
改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。
b.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。
可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。
改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，附加VB2或PG等减少愈伤，改变生根培养程序等。
II组培苗的褐化问题[6]很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。
影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。
一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。
培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。
6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐化的作用。
