实验报告
课程名称： 生化实验甲 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称：植物基因组DNA 的提取 实验类型： 生化定性实验 同组学生姓名： 及纯度与含量的测定 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组DNA 的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA 结果的初步分析； 4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA 纯度与含量的方法。 二、实验基本原理 植物基因组DNA 的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和
核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA 得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物基因组 DNA 溶液。
由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA 降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA 聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA 提取法步骤多，较烦琐，DNA 产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。SDS 法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA ，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA 的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
本实验采用十二烷基硫酸钠 (SDS)法提取植物基因组DNA ，基因组DNA 提取后， ①通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA 分子量大小、纯度；②用紫外吸收法测定基因组DNA 纯度与含量。
DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
DNA 分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA 片段泳动速度不同。DNA 片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB ）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA 片断在凝胶中的位置。
紫外吸收法测定基因组DNA 纯度与含量
核酸——DNA 和RNA 所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm 处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm 波长进行核酸含量的测定。
波长为260nm 时，DNA 或RNA 的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。
对标准样品来说，浓度为1μg / ml 时，DNA 钠盐的OD260＝0.02。
当OD260＝1时，双链DNA含量约为50μg / ml
单链DNA含量约为37μg / ml
RNA含量约为40μg / ml
寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异）
1、核酸样品DNA、RNA含量的测定：
如用1cm光径石英比色皿，用H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量：
DNA（μg/μl）=50×OD260读数×DNA样品稀释倍数/1000
RNA（μg/μl）=40×OD260读数×RNA样品稀释倍数/1000
若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。由于DNA 在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。
2、核酸样品纯度判断的一般标准：
⑴DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA；
OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染；
OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。
⑵RNA纯度：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0，表示为纯的RNA；
OD260/OD280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染；
OD260/OD280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。
⑶OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。
若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和PCR 的效果。
三、实验材料与试剂
1、实验材料：植物幼嫩叶子
2、实验试剂
（1）基因组DNA提取缓冲液
（2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液
（3）TE缓冲液
（4）平衡酚：
（5）RNA酶A
（6）酚/氯仿
（7）氯仿/异戊醇
（8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。
（9）3mol/L NaAc
（10）5×TBE缓冲液
（11）6×电泳上样缓冲液
（12）1.0%琼脂糖凝胶
（13）EB
（14）DNA分子量Markers：125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.
（15）ddH2O；
