番茄YABBY基因家族的生物信息学分析

拟南芥和番茄基因组的比较进化研究拟南芥和番茄是非常重要的模式植物，在生物学和遗传学研究中都扮演了重要的角色。

这两种植物的完整基因组序列已被测定，为研究它们的基因组和生态学进化提供了广泛的可能性。

本文就是要介绍这两种植物基因组的比较和它们的演化历史。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种广泛分布的小型草本植物，在世界范围内都可以找到。

拟南芥的大小和矮生态使它成为理想的模式植物。

因为它的遗传特性已被广泛研究过，所以现在已经具有了完整的基因组序列。

这些研究揭示了拟南芥分子生物学和生态学的深层次知识。

在拟南芥之外，番茄(Solanum lycopersicum)也成为了重要的模式植物之一。

番茄是第二大的蔬菜作物，与其他作物相比，番茄具有良好的遗传多样性和可塑性，这使得它成为了分子生物学和生物技术领域的热点研究对象。

正是因为这样的优势，番茄的基因组被广泛地研究，它的完整基因组序列也在2001年被测定出来。

比较拟南芥和番茄的基因组时，发现它们在进化上有很大的不同。

从染色体数量和大小开始，拟南芥总共有5条染色体，而番茄则有12条染色体。

而且在染色体的结构和形态上，拟南芥的染色体相对较小，也比番茄更均匀。

深入挖掘它们的演化历史，发现它们的共同祖先应该生活在3亿年前。

到了2.88亿年前，这个祖先植物开始经历一次基因组重组，使之分化成分别属于不同门的拟南芥和番茄。

在拟南芥和番茄的基因组中，还可以寻找到一些区别。

拟南芥的基因组中含有非常丰富的基因家族，包括代表性元件、反转录转座子、线性DNA和DNA元件。

同时，也发现拟南芥基因组中有大量的非编码RNA(non-coding RNA)。

此外，拟南芥基因组还有很多复杂的基因互作网络，这些网络控制着植物的生长和发育。

番茄的基因组则相对较为简单，除了MADS-box转录因子家族外，其它的基因家族相对较少，并且也没有大量的非编码RNA。

这表明，虽然这两种植物具有相似的生态特点，但它们具有不同的基因组特征。

番茄由小到大的秘密--番茄基因组学研究又一重要成果
李颖
【期刊名称】《中国蔬菜》
【年(卷),期】2014(000)011
【摘要】中国农业科学院蔬菜花卉所研究员黄三文领导的国际番茄变异组研究团
队对世界各地的360份番茄种质进行了重测序分析,构建了完整的番茄遗传变异组
图谱,为揭示番茄的进化历史、基因挖掘和分子育种奠定了基础.最新研究成果以长
篇幅论文在线发表于2014年10月13日的《Nature Genetics（自然·遗传学）》杂志.该研究是中国农业科学院蔬菜花卉研究所功能基因组创新团队近年来在《Nature》、《Nature Genetics》、《PNAS》、《PLoS Genetics》等刊物上
发表多篇研究论文后,又-次在国际知名杂志发表的重要研究成果.
【总页数】1页(P95-95)
【作者】李颖
【作者单位】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【正文语种】中文
【相关文献】
1.变异组研究揭示番茄由小变大的秘密 [J],
2.智能管理系统研究的又一重要成果--评《智能财会决策支持系统研究》 [J], 魏
世泽
3.Micro-Tom 番茄矮化微型机制及其在植物功能基因组学研究中的应用 [J], 刘小花;张岚岚;朱长青;陈昆松;徐昌杰
4.中国农科院变异基因组研究揭示“番茄由小到大” [J],
5.利用番茄突变体进行功能基因组学研究 [J], 赵心爱;薛庆中
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2021综述番茄开花诱导、分生组织的分子生物学研究范文 引言 开花植物（被子植物）作为陆生植物中最大的族群，现已超过了250000种。

开花对于所有开花植物来说是生活史上的一个质变过程，是植物个体发育过程的中心环节；而对于人本身来说，色彩斑斓、气味芬芳的花不仅愉悦了人的身心，种类繁多的种子与果实也为人类提供了丰富的食物。

故研究开花植物的开花过程，阐明其分子生物学上的调控机理无论在理论上还是在应用上都具有重要意义。

Yanofsky 等（1990）在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中首次克隆了花同源异型基因agamous（AG），标志着高等植物花发育研究进入分子遗传学阶段。

从发育生物学角度来看，高等植物经过一段时期的营养生长后，在合适的外界条件（其中重要的有日照长度、光质及温度）下，才能进行由营养生长（vegetativedevelopment）向生殖生长（reproductivedevelopment）的转变，才能开始花的发育。

总的来说，花的发育过程在时间上大致分为4个阶段：（1）开花过渡（flowering transition），植株响应外界环境以及自身信号，由营养生长转向生殖生长，这个过程受一系列与开花时间相关基因的调控；（2）分生组织特征基因激活，植株响应从不同开花时间调控途径而来的信号，激活分生组织特征基因，决定分生组织属性；（3）花器官特征基因的激活，分生组织特征基因激活位于不同区域的花器官特征基因；（4）花器官形态建成，花器官特征基因激活下游的器官形态建成基因，决定组成各器官的特异细胞类型和组织（Jack, 2004）。

番茄（Solanumlycopersicum L.）是很重要的经济作物，同时也是用于双子叶植物花发育机理研究的一个重要模式植物。

通过多年来不断的分子生物学上的深入研究，已有10个与番茄开花诱导及分生组织特征相关的基因被鉴定，将番茄与拟南芥相关基因比较发现两物种在花发育分子生物学上兼具保守性和多样性（表1）。

番茄红素β-环化酶基因(LcyB)启动子调控LcyB RNAi双元载体构建莫爱琼;文了;黎海燕;马丽;万小荣【摘要】根据番茄基因组DNA序列信息设计引物进行PCR扩增了Micro-Tom 中番茄红素β-环化酶(Lycopeneβ-cyclase,LcyB)基因起始密码子上游1 534 bp 启动子区域序列(LcyBp),生物信息学分析表明,该启动子序列中存在TA-TA-盒、CAAT-盒、昼夜节律响应元件Circadian、光响应元件Box Ⅰ、真菌激发子响应元件Box-Wl、低温响应元件LTR、响应赤霉素的作用元件P-box、乙烯响应元件ERE、响应生长素的作用元件TGA-element等顺式作用元件.依据番茄LcyB基因序列,设计2对含有不同酶切位点的特异引物进行PCR扩增LcyB基因3'端特异的276 bp DNA片段,利用RNAi载体pKANNIBAL构建了“LcyB启动子-LcyB基因正义片段(Sense)-PDK内含子-LcyB基因反义片段(Antisense)-OCS终止子”的RNAi表达框,并将这一RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的NotⅠ位点,构建成本研究的LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB.为利用RNAi技术特异性敲除LcyB基因进而提高番茄果实中番茄红素含量奠定实验基础.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(048)004【总页数】7页(P50-56)【关键词】番茄;番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase,LcyB);启动子;RNAi双元载体【作者】莫爱琼;文了;黎海燕;马丽;万小荣【作者单位】仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225【正文语种】中文【中图分类】Q945.1番茄红素(Lycopene)具有淬灭单线态氧、清除自由基、诱导细胞间连接通讯、调控细胞增殖等多种功能，尤其是对某些癌细胞增殖的抑制作用比α-胡萝卜素和β-胡萝卜素更强，因而成为现在最受关注的类胡萝卜素色素之一，是目前国际功能食品研究和化妆品与食品添加剂研究的焦点，有希望成为最重要的一个化学防癌物质，对人类健康有重要意义[1-2].在高等植物中番茄红素是由八氢番茄红素脱氢转变而来的，番茄红素的代谢途径主要是其环化反应，特别是番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase, LcyB)催化其环化形成β-胡萝卜素，是其主要代谢途径，PECKER等[3]克隆鉴定了番茄中编码番茄红素β-环化酶的LcyB 基因，发现其表达在果实后熟阶段降低，从而利于果实中番茄红素的积累. 目前成功的相关转基因植物报道的工作是在类胡萝卜素合成品种中过表达正向催化番茄红素前体合成的关键酶基因，希望提高转基因植株中番茄红素的含量，但由于向番茄红素合成支路的流向增大，往往导致其它以异戊二烯类化合物为前体的合成途径底物缺乏，而对转基因植株的生长发育造成不利影响[4-5]. 例如组成型表达八氢番茄红素合成酶基因的转基因番茄中，因为与赤霉素的生物合成途径竞争牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)前体导致植株矮化等现象，因而无法应用于农业生产[4]. 2000年以色列科学家利用番茄Beta突变体的研究[6]表明，该突变体果实“后熟”期间番茄红素水平明显低于野生型，进一步研究发现这种突变表型是由于第6染色体上编码番茄红素β-环化酶的LcyB基因高表达所致，即番茄红素环化反应增强，大量转变生成β-胡萝卜素了. 迄今尚无番茄中LcyB基因启动子研究的有关报道.一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，使特异mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，这一过程称为双链RNA干扰(Double-stranded RNA interference, 简称RNAi)[7-8]. RNAi作为一种反向遗传学的研究方法，为后基因组时代基因功能的分析提供了一种可靠、快速的应用技术平台. 本实验从新型模式植物微型番茄(Micro-Tom)中克隆LcyB基因5’上游启动子序列，并构建其驱动的特异静默LcyB基因的RNAi植物双元表达载体，为在此基础上利用RNAi技术特异性敲除番茄果实中的LcyB基因，通过阻断番茄果实中番茄红素的环化反应来终止以番茄红素为底物继续进行的代谢途径，进而获得番茄红素高富集的优质番茄奠定实验基础.1.1 植物材料微型番茄(Lycopersicon esculentum,称作Micro-Tom)是一种新型模式植物，其生命周期短，从播种到果实成熟只需约70 d，且生长密度高，可达约1 357株/m2；农杆菌介导的Micro-Tom子叶转化频率高，约达80%；Micro-Tom中只有2个主要基因(Dwarf Gene和Miniature Gene)与普通番茄不同[9-10]. 上述特征大大方便了番茄的突变和转基因，且使基因敲除的应用更为便利. Micro-Tom 种子播种在泥炭土中，生长条件为：光周期，16 h光/8 h暗；温度，25±1 ℃. 萌发生长约20 d后取番茄叶片备用.1.2 Micro-Tom LcyB基因5’上游启动子序列克隆采用SDS法提取Micro-Tom叶片基因组DNA[11]. 根据DNA数据库中报道的番茄基因组DNA序列信息(GenBank Accession No. KP233172)设计一对引物(LcyBp-F: 5’-CGRYCGTTCAGTCGTCTTAGGC-3’和LcyBp-R: 5’-CTCGAGACCATTATAGAGAATG-3’)，以Micro-Tom基因组DNA为模板，进行PCR扩增LcyB基因5’上游启动子序列，将PCR产物克隆到pMD 19-T (Simple) 载体(TaKaRa)上，通过PCR和酶切检测获得阳性克隆(含质粒pMD-LcyBp)后，挑阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序，获得Micro-Tom LcyB基因5’上游启动子序列(命名为LcyBp).1.3 LcyB基因启动子序列的生物信息学分析将上述克隆的Micro-Tom LcyB基因启动子序列在植物顺式作用元件数据库中的信号扫描程序进行生物信息学分析，搜寻该启动子序列中可能响应外界环境刺激和发育信号的顺式作用元件.1.4 LcyB基因启动子驱动的特异静默LcyB基因的RNAi双元表达载体构建构建LcyB基因RNAi植物表达载体时，本研究选用质粒pKANNIBAL作为基本克隆载体. 以引入的Mcr I和Xho I 2个限制性内切酶酶切质粒pMD-LcyBp，获取LcyBp片段替代质粒pKANNIBAL上的CaMV 35S 启动子，构建成含Micro-Tom LcyB基因启动子的中间RNAi质粒pK-LcyBp.根据DNA数据库中报道的番茄LcyB基因序列信息(GenBank Accession No. AEKE02020044)设计引物RNAi-S1(5’-CTCGAGGATCTTGATCCTAAATACTGGC-3’)和RNAi-S2(5’-GGTACCTGACAGTATGTAGCTCTTATCTCAC-3’)、以及RNAi-AS1(5’-AAGCTTGATCTTGATCCTAAATACTGGC-3’)和RNAi-AS2(5’-ATCGATTGACAGTATGTAGCTCTTATCTCAC-3’)扩增LcyB基因3’端276 bp 片段，在上述4条引物5’端分别引入Xho I、Kpn I和Hind III、Cla I酶切位点. 将2个PCR产物分别克隆到载体pMD 19-T (Simple) (TaKaRa)上，通过PCR、酶切检测及测序验证获得阳性克隆(分别含质粒pMD-RNAiS及质粒pMD-RNAiAS).以Xho I和Kpn I 2个限制性内切酶双酶切质粒pK-LcyBp及质粒pMD-RNAiS，分别回收质粒pK-LcyBp的大片段和质粒pMD-RNAiS酶切后的LcyB基因片段，连接构建成中间RNAi质粒pK-LcyBp-RNAiS；以Hind III和Cla I 2个限制性内切酶双酶切pK-LcyBp-RNAiS及pMD-RNAiAS这2个质粒，分别回收质粒pK-LcyBp-RNAiS的大片段和质粒pMD-RNAiAS酶切后的LcyB基因片段，连接构建成中间RNAi质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB.再利用Not I从质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB切下LcyBp::LcyB RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的Not I位点，最后构建成本研究的RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB.2.1 Micro-Tom LcyB基因启动子序列克隆与生物信息学分析根据DNA数据库中报道的番茄基因组DNA序列信息设计一对引物，以Micro-Tom基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果扩增出一条约1 500 bp的DNA片段(图1)，将此片段回收后克隆到载体pMD 19-T (Simple)上，通过PCR和酶切检测、筛选，获取含质粒pMD-LcyBp的阳性克隆. 挑阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明PCR产物为1 551 bp的DNA序列. 对此序列进行BLASTn分析(/Blast.cgi)，结果表明其与GenBank DNA数据库中报道的番茄基因组DNA序列信息完全吻合，说明所克隆的DNA序列为Miro-Tom LcyB基因起始密码子ATG上游启动子区域序列(图2). 将克隆的LcyB基因启动子区域序列在国际植物顺式作用元件数据库PlantCARE[12]中进行生物信息学分析，搜寻该启动子序列中可能的响应发育信号和外界环境刺激的顺式作用元件(图2). 在该启动子序列-137～-132(LcyB基因起始密码子ATG上游)处有典型的TATA-box，核心序列为ATATAA[13]；-107～-104处有CAAT-box，核心序列为CAAT[14]；在-298～-289、-275～-266及-116～-107处有典型的响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian，核心序列分别为CAAAAATATC、CAAACACATC及CAAAAGCATC[15]；-326～-320处有光响应元件Box I，保守序列为TTTCAAA[16]；在-783～-778及-315～-310处有真菌激发子(Elicitor)响应元件Box-W1，核心序列为TTGACC[17]；在-712～-707及-383～-378处有低温响应元件LTR，核心序列为CCGAAA[18]；另外，在该启动子序列中存在一些响应几种植物激素的顺式作用元件，如-1 352～-1 346及-920～-914处响应赤霉素的作用元件P-box，核心序列为CCTTTTG[19]；-327～-320处的乙烯响应元件ERE，核心序列为ATTTCAAA[20]；-995～-990响应生长素的作用元件TGA-element，核心序列为AACGAC[13](表1). 序列分析结果表明，所克隆的DNA序列为Micro-Tom LcyB基因起始密码子上游包含各种响应植株发育信号和外界环境刺激的顺式作用元件的启动子区域序列.2.2 LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi双元表达载体构建以限制性内切酶Mcr I和Xho I双酶切质粒pMD-LcyBp，回收LcyBp启动子片段克隆到质粒pKANNIBAL的Mcr I和Xho I位点，替换其中的CaMV 35S 启动子，构建成含番茄LcyB基因启动子的中间RNAi质粒pK-LcyBp. 对构建的载体pK-LcyBp进行PCR和双酶切检测,结果以LcyBp-F和LcyBp-R为引物可特异地扩增出1 551 bp的LcyBp片段，以Mcr I和Xho I 2个限制性内切酶双酶切质粒pK-LcyBp可切下相应大小的DNA片段(图3)，说明载体pK-LcyBp构建正确.以Micro-Tom基因组DNA为模板，分别以RNAi-S1和RNAi-S2以及RNAi-AS1和RNAi-AS2为引物，进行PCR扩增LcyB基因3’端276 bp的DNA片段. 按图4的流程构建LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体. 用限制性内切酶Xho I和Kpn I双酶切质粒pK-LcyBp，将LcyB基因片段用同样的酶从质粒pMD-RNAiS上切下，然后将2个片断用连接酶连接，构建成质粒pK-LcyBp-RNAiS. 用限制性内切酶Hind III和Cla I双酶切pK-LcyBp-RNAiS，并以同样的酶从质粒pMD-RNAiAS上切下LcyB基因片段，再回收2片段并连接，构建成中间RNAi质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB. 再利用Not I从质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB切下LcyBp::LcyB RNAi表达框插入载体pART27的Not I位点，最后构建成Micro-Tom LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB.对构建的载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB进行PCR、酶切及测序检测，结果以LcyBp-F和LcyBp-R为引物可特异地扩增出1 551 bp的LcyBp片段；分别以Xho I/Kpn I和Hind III/Cla I双酶切质粒pART-LcyBp-RNAi-LcyB，均可切下276 bp的LcyB基因片段；以Not I单酶切质粒pART-LcyBp-RNAi-LcyB，得到与预期大小一致的2个片段(图5). 进一步对质粒pART-LcyBp-RNAi-LcyB所有经连接的接合处(Junction Area)进行测序，结果表明，构建质粒的接合处序列都与预期一致，构建过程中未发生碱基插入、缺失等造成的读码框变化. 说明已成功构建Micro-Tom LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体(图6).近年来伴随番茄红素重要生理功能的发现，利用基因工程技术改造番茄红素合成途径，提高农作物番茄红素含量的研究成为类胡萝卜素研究领域的新热点. 植物中转入番茄红素合成关键酶同源序列很强的基因非常容易发生基因静默(Gene silencing)，从而会降低番茄红素的含量.RNAi具有高度的特异性，只引起与dsRNA同源的mRNA的降解，在由21～23个核苷酸构成的siRNA(small interfering RNA)中只要改变1个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶向mRNA起作用[21]. 已有大量研究[7-8, 21-24]证实RNAi可高效特异地抑制特定基因的表达，获得功能性丧失，从而成为研究基因功能的良好工具. 本实验从Micro-Tom中克隆了LcyB基因起始密码子上游1 534 bp的启动子区域序列，利用RNAi中间载体pKANNIBAL构建了“番茄LcyB启动子-LcyB基因正义片段(Sense)-PDK内含子-LcyB基因反义片段(Antisense)-OCS终止子”的结构，并将这一结构以Not I从质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB上切下，插入植物双元表达载体pART27的Not I位点，最后构建成本文的RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB. 故可使将来转基因植物中经转录就形成了具有“LcyB基因正义片段-PDK内含子-LcyB基因反义片段”结构的mRNA，LcyB基因正、反义片段通过链内退火，形成dsRNA，激发RNAi机制，形成siRNA，能够与内源LcyB基因转录的mRNA发生特异性作用，使LcyB基因在转录后水平沉默(PTGS).许多报道的转基因实验中所用的启动子多为组成型启动子，如CaMV 35S，在它的调控下，外源基因在转基因植物中所有的发育阶段和所有的部位都能表达，对于需要组织特异性表达的基因来说，在该启动子调控下表达造成营养浪费而常导致植株生长不良，如上述Fray和Grierson将番茄八氢番茄红素合成酶基因在组成型启动子调控下转入番茄，结果幼果异常生长，植物矮化. 在基因工程研究中对于组织或器官特异性启动子的需求是很大的，也越来越受到研究人员的重视. 因此本研究是采用番茄LcyB基因本身的启动子调控LcyB基因RNAi片段的表达，将可更加特异地阻抑LcyB基因在番茄中的时空表达.【相关文献】[1] 谭新平, 王银娜, 刘昕. 番茄红素与癌 [J]. 天然产物研究与开发, 2001, 13(4): 71-75. 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ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７２ ７９８３．２０２０．０３．００４番茄遗传图谱与基因定位研究进展杜海东，游　茜，李毅丰，毛秀杰，张　宁，王　帅（河北科技师范学院园艺科技学院，河北秦皇岛，０６６６００）摘要：对国内外关于番茄遗传图谱的构建以及叶色突变、果实质量、果实形态、果实品质、抗病性等重要性状基因定位研究进行了归纳总结，并对今后的研究趋势进行了展望。

关键词：番茄；遗传图谱；基因定位；研究进展中图分类号：Ｓ６４１．２０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２ ７９８３（２０２０）０３ ００２０ ０６番茄（ＳｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＬ．）是研究植物遗传学、分类学、生理学、分子生物学等学科的重要实验材料。

现阶段番茄育种目标主要集中在：增产量、提品质、多抗性、促早熟等［１］。

但传统育种技术对土地面积需求较大、容易受外界环境条件影响、育种效率低、周期长；而分子标记辅助选择（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｒｋｅｒＡｓｓｉｓｔｅｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ，ＭＡＳ）育种可以在分子水平上直接反应遗传本质的优点，快速、准确地筛选出目标性状，缩短育种时间，加快种质资源创新进程。

分子标记辅助选择育种将会成为现代作物遗传育种的主要潮流，而获得与目的基因紧密连锁的分子标记是分子标记辅助选择育种的重要基础，实现这一目标的主要手段便是构建高密度遗传图谱［２］。

遗传图谱是依据染色体交换与重组，以多态性的遗传标记为“路标”，以标记间重组率为“图距”，确定不同多态性标记位点在每条连锁群上排列顺序和遗传距离的线性连锁图谱［３，４］。

高密度、高分辨率遗传图谱的构建是进行基因定位、基因克隆、基因结构与功能研究和标记辅助选择育种的前提。

构建遗传图谱包括：（１）选择用于建立作图群体的亲本组合；（２）构建研究所需的暂时或永久性作图群体；（３）选择合适的对群体基因型进行鉴定的多态性分子标记；（４）对标记基因型数据进行连锁分析，应用作图软件绘制遗传图谱［５］。

江苏农业学报(Jiangsu J.of Agr.Sci.),2014,30(6):1267~1272h ttp://www.js n y x 葛　敏,吕远大,张体付,等.玉米YABBY 基因家族的全基因组鉴定与分析[J].江苏农业学报,2014,30(6):1267⁃1272.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4440.2014.06.013玉米YABBY 基因家族的全基因组鉴定与分析葛　敏,　吕远大,　张体付,　李　坦,　张晓林,　赵　涵(江苏省农业科学院农业生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室,江苏南京210014)收稿日期:2014⁃05⁃25基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(12)2032]作者简介:葛　敏(1986⁃),女,湖北当阳人,硕士,研究实习员,研究方向为作物遗传育种㊂(E⁃mail)gemin8614@通讯作者:赵　涵,(Tel)025⁃84390751;(E⁃mail)zhaohan@ 摘要:　YABBY 基因家族作为植物特有的转录因子家族,在调控植物侧生器官发育中发挥重要作用㊂本研究利用玉米全基因组数据分析玉米YABBY 基因家族,阐明该基因家族成员结构㊁系统进化发育关系以及基因家族成员在玉米不同组织及不同发育时期的表达谱㊂结果显示,玉米参考基因组中存在13个YABBY 基因,命名为ZmY⁃ABBY1~ZmYABBY13,根据系统发育关系和序列相似性将该基因家族分为4亚类S1~S4㊂RNAseq 数据显示玉米YABBY 基因在籽粒㊁茎和茎端分生组织(Shoot apical meristem,SAM)㊁幼胚及叶片中有较高表达,预示玉米YABBY 基因可能在上述器官发育中发挥调控作用㊂本研究结果为进一步解析该基因家族的功能奠定了研究基础㊂关键词:　玉米;YABBY ;转录因子;表达谱中图分类号:　S634.3 文献标识码:　A 文章编号:　1000⁃4440(2014)06⁃1267⁃06Genome⁃wide identification and analysis of YABBY gene family in maize GE Min,　LÜYuan⁃da,　ZHANG Ti⁃fu,　LI Tan,　ZHANG Xiao⁃lin,　ZHAO Han(Institute of Agro⁃biotechnology /Provincial Key Lab of Agro⁃biology ,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences ,Nanjing 210014,China ) Abstract :　YABBY gene family,as a group of plant⁃specific transcription factors,is involved in the development of lateral organs in plants.Based on maize V3genome sequence,a genome⁃wide overview of gene family in maize was presen⁃ted,including the gene structures,phylogeny,and mRNA expression atlas in 18different development stages.The analy⁃ses have revealed 13YABBY genes existing in maize genome,named ZmYABBY1-ZmYABBY13.According to the phyloge⁃netic relationships and sequence similarity,the gene family was divided into 4subgroups (S1-S4).YABBY gene expres⁃sion profiling analysis showed that some genes were highly expressed in developing seed,stem and shoot apical meristem (SAM),embryo and leaf,suggesting YABBY genes may play an positive role in the development of these tissues.The pre⁃liminary genomics analysis lays a foundation for future functional dissection of YABBY family gene.Key words :　maize;YABBY ;transcription factor;expression profiling 背腹(Adaxial /Abaxial)极性是植物侧生器官发育形成过程中建立的主要极性之一,在植物生长发育中起着重要作用[1⁃2]㊂对模式植物拟南芥YABBY基因家族的研究发现,YABBY 基因在背腹极性的建立㊁叶片扩展及花器官的发育中扮演重要角色[3⁃4]㊂YABBY 转录因子家族是锌指蛋白超家族(Zinc fin⁃ger super⁃family)的亚家族,含有2个结构域:位于N端的锌指结构域(C 2C 2)和位于C 端与HMG box 相似的 螺旋⁃环⁃螺旋”结构域(又称YABBY 结构域)[5]㊂YABBY 基因家族在双子叶植物中研究得较为清楚㊂目前拟南芥YABBY 基因家族有6个成员:7. All Rights Reserved.FILAMENTOUS FLOWER(FIL)㊁CRABS CLAW (CRC)㊁INNER NO OUTER(INO)㊁YAB2㊁YAB3和YAB5[6⁃9],以上基因在侧生器官发育中发挥不同作用㊂FIL参与花器官的发育[7],CRC参与蜜腺和心皮极性的形成[8],INO对外部珠被的发育极为重要[9]㊂系统进化分析表明FIL和YAB3的亲缘关系很近,这可能源于基因的复制,并且这2个基因均在发育器官初始原基的远轴面细胞表达,决定远轴面细胞的命运㊂相对于拟南芥其他YABBY基因,YAB2和YAB5与FIL/YAB3亲缘关系更近[10]㊂拟南芥双突变体(filyab3)㊁三突变体(filyab3yab5)和四突变体(filyab3yab5yab2)会导致花器官发育异常,叶片极性丧失呈辐射状,茎端分生组织(Shoot apical mer⁃istem,简称SAM)发育异常[11⁃13]㊂随后在金鱼草㊁番茄㊁白菜等双子叶植物中也发现YABBY基因家族成员,其与拟南芥YABBY基因功能相似[5,14⁃15]㊂YABBY基因家族在单子叶植物中研究相对较少㊂目前水稻基因组中有8个YABBY基因:DL (DROOPING LEAF)㊁OsYABBY1~OsYABBY7[16]㊂其中DL基因功能研究深入,DL突变体花器官心皮发育为雄蕊,叶片不能形成中脉[17];水稻中OsYABBY1与其他YABBY基因不同,其可能参与调控一些特定细胞类型(例如厚壁组织细胞)的分化,但与侧生器官发育的极性调控无关㊂根据FIL㊁YAB2㊁YAB3保守结构域序列在玉米中同源克隆到zyb9和zyb14,这2个基因仅在叶原基近轴面表达,可能参与调控玉米叶片发育[10]㊂此外国内学者在小麦中分离到2个YABBY基因:TaYAB1和TaCRC,可能在小麦背腹极性建立中发挥重要转录调控作用[18]㊂本研究基于最新版玉米基因组数据鉴定玉米YABBY转录因子家族,拟从3个方面阐明该家族:基因家族成员结构㊁系统进化发育关系以及基因家族成员在玉米不同组织及不同发育时期的表达谱,以期鉴定玉米基因组中所有YABBY基因,并初步分析该基因家族的结构和功能㊂1　材料与方法1.1　基因组数据基因组数据为最新版(V3)玉米自交系B73参考基因组数据(/Zea_ mays/Info/Index);拟南芥YABBA基因家族蛋白序列来自PlantTFDB(Plant transcription factor database V3.0)数据库;玉米自交系B73不同组织及不同发育时期的RNA⁃Seq数据来自NCBI SRA数据库(ht⁃tp:///sra),编号分别为SRR404131~SRR404132㊁SRR404139~SRR404150㊁SRR404152~SRR404156㊁SRR404158~SRR404164㊁SRR404171~SRR404200㊁SRR404202~SRR404203㊂1.2　玉米YABBY基因家族的鉴定YABBY基因家族具有相对保守的结构域(锌指和YABBY结构域)㊂鉴于此,我们利用Pfam数据库构建YABBY家族的隐马尔科夫模型文件(YABBY.hmm,PF04690),并利用HMMER3.0软件包中的hmmersearch程序对玉米B73全基因组进行比对搜索,以获取玉米基因组中包含上述2个保守结构域的所有基因㊂随后,利用初筛的玉米YABBY家族序列,重新构建该家族Hmm模型文件,重新比对进而获得更为全面的全基因组YABBY基因家族信息㊂所有YABBY基因均进一步通过PlantTFDB㊁NCBI CDD(Conserved domain da⁃tabase)数据库验证㊂验证后的YABBY基因家族通过自行编写的Perl程序,解析并释放出每个成员的基因组位置信息㊂由于玉米V3注释数据是来自于不同策略所获得的基因集合,其中存在一定的冗余现象㊂鉴于此,我们通过基因组对应的位置以及序列相似性对最终所鉴定的YABBY基因进行了去冗余处理㊂1.3　拟南芥和玉米YABBY基因家族的系统发育分析 为探究YABBY基因家族内的进化关系,我们将拟南芥和玉米YABBY基因家族进行了一个合并的系统进化分析㊂首先利用ClustalX软件对玉米和拟南芥YABBY基因家族进行多重序列比对,并进行人工校正㊂随后,利用MEGA6.0软件,使用邻近法(Neighbor⁃joining algorithm)对YABBY家族构建系统发育进化树,Bootstrap值设为1000次重复以获得更为可靠的分支聚类㊂1.4　玉米YABBY基因家族表达谱分析为了进一步解析玉米YABBY基因家族的表达模式,我们利用玉米B73不同组织及不同发育时期RNA⁃Seq数据,系统分析其家族成员在玉米B73中的表达谱模式㊂首先,所有RNA⁃Seq数据均进行了预处理,主要包含低质量Q20(Phred值≥20即1%的错误率)清理㊁Reads读长(L≥408621江苏农业学报　2014年第30卷第6期. All Rights Reserved.bp)过滤㊁rRNA及病毒序列过滤,从而获得高质量序列(Cleaned reads)㊂随后利用Tophat2程序将序列比对到玉米V3参考基因组㊂进一步利用eX⁃press程序解析比对结果,统计分析获得YABBY基因家族成员相应的表达量(FPKM值,fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)㊂最后,利用MEV4.9软件绘制YABBY基因家族的Heatmap图,并分析表达模式㊂2　结果与分析2.1　玉米YABBY基因家族的鉴定和分析利用HMMER3.0软件共比对搜索到31条蛋白序列,经PlantTFDB㊁NCBI CDD数据库验证所有蛋白均为YABBY蛋白㊂通过去冗余处理,这31个蛋白分别对应13个基因㊂将这13个玉米YABBY基因命名为ZmYABBY1~ZmYABBY13,基本信息如表1所示㊂经HMMER软件比对所得YABBY蛋白全序列和保守结构域对应的E值均很低,说明鉴定结果可信度高㊂蛋白长度为160~320aa,差异较小㊂玉米YABBY基因在第1染色体上分布最多,为4个;在第5染色体上分布次之,为3个;在第7染色体上分布2个ZmYABBYs;另外第2条㊁第3条㊁第9条和第10条染色体上各分布1个ZmYABBY基因㊂表1　玉米YABBY基因家族Table1　YABBY gene family in maize基因名称V3版基因名称蛋白全序列比对E值保守结构域比对E值蛋白长度(aa)染色体起止位点(bp)ZmYABBY1GRMZM2G088309 3.4e⁃66 2.1e⁃37205126576546~26581707 ZmYABBY2GRMZM2G141955 2.1e⁃69 6.4e⁃682061175665423~175671655 ZmYABBY3GRMZM2G167824 2.7e⁃68 2.1e⁃373201225097097~225102315 ZmYABBY4GRMZM2G085873 5.3e⁃68 2.1e⁃371601*********~260427079 ZmYABBY5GRMZM2G054795 4.7e⁃59 2.1e⁃37254223380099~23382093 ZmYABBY6GRMZM2G116646 2.3e⁃58 3.3e⁃68216389439022~89445313 ZmYABBY7GRMZM2G074124 2.3e⁃50 2.5e⁃69192516146472~16181777 ZmYABBY8GRMZM2G074543 2.3e⁃50 2.1e⁃37314523592937~23597115 ZmYABBY9GRMZM2G529859 1.3e⁃43 2.1e⁃372235189249290~189252175 ZmYABBY10GRMZM2G106204 2.7e⁃27 3.8e⁃6616976315293~6328611 ZmYABBY11GRMZM2G046829 5.5e⁃22 2.1e⁃371767159501156~159503146 ZmYABBY12GRMZM2G102218 2.3e⁃20 2.1e⁃373089146951299~146956590 ZmYABBY13GRMZM2G005353 1.1e⁃06 2.1e⁃3726810133133767~1331364012.2　玉米YABBY结构域的多重序列比对和结构特征 利用ClustalX软件对玉米YABBY基因家族进行多重序列比对,抽取所含的2个保守结构域锌指结构域和YABBY结构域进行观察分析(图1)㊂图1中蛋白顺序按氨基酸序列相似性进行排列,黑色背景的氨基酸序列完全一致,灰色背景氨基酸序列非常相似,由此可见以上2个结构域都很保守㊂锌指结构域包含C2C2保守基序,能构成C2C2型单锌指结构;YABBY结构域相似性极高,某种程度上预示该结构域可能执行特定的功能㊂从图中可见YAB⁃BY家族中含2个特殊蛋白:ZmYABBY4和ZmYAB⁃BY9,其在锌指结构域前端存在一定程度的缺失, YABBY结构域完整㊂经全基因组扫描和多次验证以上2个蛋白均为YABBY蛋白㊂这2个蛋白是否能形成有功能的结构域将在后续的基因功能验证上进一步探究㊂2.3　拟南芥和玉米YABBY基因家族的系统发育分析 根据拟南芥和玉米YABBY基因家族序列相似性和系统发育进化树(图2)的拓扑结构,将玉米和拟南芥YABBY基因分为4个亚类(subgroup)S1~S4㊂9621葛　敏等:玉米YABBY基因家族的全基因组鉴定与分析. All Rights Reserved.I:锌指结构域(C2C2型);II:YABBY结构域㊂黑色背景的氨基酸序列完全一致;灰色背景的氨基酸序列非常相似㊂*表示C2C2型锌指结构㊂图1　玉米YABBY蛋白保守结构域分析Fig.1　Conserved motif analysis of YABBY proteins in maizeS1亚类包含9个基因,4个拟南芥基因(FIL㊁YAB2㊁YAB3和YAB5)和5个玉米基因(ZmYABBY3㊁ZmY⁃ABBY5㊁ZmYABBY8㊁ZmYABBY9㊁ZmYABBY13),5个玉米基因与拟南芥FIL/YAB3类基因同源性高㊂前人根据FIL㊁YAB2和YAB3保守序列同源克隆得到的zyb9和zyb14基因在本研究中对应ZmYABBY8和ZmYABBY13[10]㊂S2亚类包含4个基因,均为玉米基因(ZmYABBY2㊁ZmYABBY4㊁ZmYABBY6㊁ZmYABBY7),这4个基因不与拟南芥任何基因同源,预示其可能为玉米进化中的一个特有分支㊂S3亚类包含3个基因,1个拟南芥基因CRC和2个玉米基因(ZmYABBY1㊁ZmYABBY12)㊂S4亚类包含2个基因,1个拟南芥基因INO和1个玉米基因ZmYABBY11㊂此外,玉米基因ZmYABBY10不属于任何一个亚类独立出来㊂2.4　玉米YABBY基因家族表达谱分析对玉米不同组织及不同发育时期RNA⁃Seq数据进行预处理和统计分析后,获得了YABBY基因家族成员对应表达量的FPKM值,最后根据FPKM值利用MEV4.9软件绘制出该家族表达量的Heatmap图谱(图3)㊂图中结果显示,玉米YABBY基因家族成员主要在籽粒㊁茎和茎端分生组织(SAM)㊁幼胚及叶片中有较高表达,在胚乳及根部表达较低㊂约69%(9/13)的ZmYABBYs在授粉10d后的籽粒中表现出最高的表达量,在V3时期茎和SAM及授粉16d后幼胚中约有46%(6/13)的ZmYABBYs具有最高的表达量,约23%(3/13)的ZmYABBYs在V9时期第13片叶中表现出最高的表达量㊂随授粉后天数的推迟(授粉后10d㊁12d㊁14d㊁16d)在籽粒中具最高表达量的ZmYABBYs基因数目递减(9㊁7㊁5㊁4),说明在授粉后初期ZmYABBYs在籽粒中表达活跃㊂ 从图3可见,玉米YABBY基因家族成员表达模式相似性较高,特别是S1和S3亚类成员表达模式相似性很高㊂S1亚类5个基因在授粉16d后幼胚中均有最高表达,部分基因在籽粒㊁茎和SAM中有最高表达,此种表达模式是S1亚类所特有的㊂S3亚类2个基因在授粉10d㊁12d㊁14d和16d后的种子中均有最高表达,表达模式相似性高㊂本研究发现玉米YABBY基因家族中ZmYABBY6在多个组织及发育时期有最高表达(萌发和授粉后籽粒㊁茎和SAM㊁多个时期叶片),在胚乳和幼胚中也有较高表达,图谱18个不同时期组织中该基因仅在根部不表达㊂此外ZmYABBY2和ZmYABBY10在不同时期及组织中表达范围也较广㊂相反S1亚类ZmYABBY5仅在幼胚中表达且表达量最高,在其他组织中几乎不表达㊂0721江苏农业学报　2014年第30卷第6期. All Rights Reserved.图2　拟南芥和玉米YABBY蛋白系统进化关系及分类Fig.2　Phylogenetic relationships and subgroup designations in YABBY proteins from Arabidopsis andmaizea:萌发24h后种子;b:V3时期茎和SAM;c:V9时期第13片叶;d:V9时期第11片叶;e:V9时期幼叶;f:VT时期第13片叶;g:R2时期第13片叶;h:V5时期叶尖;i:授粉10d后种子;j:授粉14d后种子;k:授粉12d后种子;l:授粉16d后种子;m:授粉14d后胚乳;n:V9时期第8片叶;o:授粉12d后胚乳;p:播种6d后初始根;q:授粉16d后胚乳;r:授粉16d后幼胚㊂图中黑白颜色深浅表示表达量的高低,白色表示不表达,黑色表示最高表达㊂图3　玉米YABBY基因家族表达模式分析Fig.3　Expression patterns of YABBY genes in maize3　讨论本研究在玉米基因组中共鉴定YABBY基因13个,分布于玉米7条染色体,YABBY基因在第1染色体上分布最多㊂YABBY基因家族所含结构域具有较高的保守性,预示着YABBY基因具有功能的相似性;1721葛　敏等:玉米YABBY基因家族的全基因组鉴定与分析. All Rights Reserved.同亚类玉米YABBY蛋白序列一致性强,且某些氨基酸排列方式是该亚类所特有的,预示着同亚类成员可能具有功能特异性;蛋白ZmYABBY4和ZmYABBY9虽然在锌指结构域的前端存在缺失,但在系统进化树中分别属于S2和S1亚类并且在表达谱分析中这2个基因均有表达,并非假基因,说明这2个基因的确为YABBY基因并且这种结构上存在缺失的基因为玉米YABBY基因的进化提供了另外一种可能㊂系统进化关系分析表明:S1㊁S3和S4亚类玉米YABBY基因分别与拟南芥FIL/YAB3类㊁CRC和INO基因同源,预示玉米YABBY基因与同亚类拟南芥YABBY基因间可能存在功能的相似性;此外玉米YABBY基因存在一个不与拟南芥YABBY基因同源的特有分支(S2亚类),在表达谱分析中发现该亚类基因ZmYABBY2和ZmYABBY6在多个组织中均有最高表达,特别是ZmYABBY6,是YABBY基因家族中表达范围最广的一个基因,以上结果预示在系统进化中玉米YABBY基因可能按物种特异性的方式进行了扩张㊂表达谱分析表明:玉米YABBY基因在茎和茎端分生组织㊁叶片中表达较高,这与前人研究结果一致[6⁃9],说明玉米YABBY基因可能参与调控叶原基的发育及叶片背腹极性的建立㊂与前人研究结果不同的是,玉米YABBY 基因在授粉后的种子和幼胚中表达量高,预示玉米YABBY基因可能在种子发育中也发挥调控作用㊂现代玉米高产育种的主要选择性状之一就是植株要具有紧凑株型以增强高密度种植耐性并提高群体光合效率㊂已有的研究表明YABBY基因家族可能参与调控叶与茎秆之间的角度[10]㊂本研究对玉米YABBY 基因家族进行了鉴定和初步分析,具体阐明该基因家族功能还需后续实验来验证,如通过过量表达基因㊁寻找突变体来进一步解析基因引起的表现型改变㊂参考文献:[1]　BOWMAN J L.The YABBY gene family and abaxial cell fate[J].Curr Opin Plant Biol,2000,3(1):17⁃22.[2]　REINHARDT D,FRENZ M,MANDEL T,et al.Microsurgicaland laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral pat⁃terning in tomato[J].Development,2005,132(1):15⁃26.[3]　YAMADA T,YOKOTA S,HIRAYAMA Y,et al.Ancestral ex⁃pression patterns and evolutionary diversification of YABBY genes in angiosperms[J].Plant J,2011,67(1):26⁃36. 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All Rights Reserved.。

科研NatureGenetics：高精度渐渗系群体分析揭示番茄果实风味和抗病性的遗传基础编译：李飞，编辑：Tracy、江舜尧。

原创微文，欢迎转发转载。

导读番茄的驯化和育种过程极大地改变了果实成熟及其伴随的无数代谢过程。

导致现代番茄品种丧失了一些重要的果实品质，例如抗旱和抗病能力等。

在这项研究中，作者构建了精细作图群体，进行转录组、代谢组和抗病能力测量，对番茄果实进行整合QTL分析。

所使用的580个渐渗系，在番茄栽培品种M82的背景下，每个品系均携带野生番茄Solanum pennellii的小片段遗传物质，这一群体具有极高的分辨率。

作者对整个种群的果实进行多角度的分析，包括不同发育阶段的RNA测序、基于质谱的代谢组学和病原体敏感性测定，由此产生的海量数据资源被用于多层次的QTL分析中，并确定了番茄果实中基因序列变异、基因表达和代谢产物水平的变化以及最终表型变化的因果关系。

从庞大的数据信息中，作者集中研究了与食用品质相关的代谢物质和对病原体的抗性两个方面，这两个方面是野生和驯化番茄差异最大的地方。

作者鉴定并分析了番茄果实中生物碱α-番茄碱代谢途径的关键酶，这种生物碱赋予番茄果实苦味，妨碍野生番茄被食用，但对于野生番茄抗病能力具有重要影响。

此外，作者鉴定并验证了与抗病能力相关的基因。

这些结果建立了理解番茄果实成熟过程中新陈代谢和病原体抗性的框架，并提供了对番茄果实关键品质性状的理解。

本文研究生成的大量数据为科学界提供了重要的研究资源。

论文ID原名：Analysis of wild tomato introgression lines elucidates the genetic basis of transcriptome and metabolome variationunderlying fruit traits and pathogen response译名：高精度渐渗系群体分析揭示番茄果实风味和抗病性差异的遗传基础期刊：Nature geneticsIF：27.603发表时间：2020.10通讯作者：Asaph Aharoni通讯作者单位：以色列雷霍沃特魏兹曼科学研究所植物与环境科学系实验设计实验结果1.对580个渐渗系的果实进行分析，获得多组学数据资源作者在两个果实发育阶段（破色期，开花后约44 d和红色期，开花后约48 d）对580个自交系的果皮进行分析（图1a）。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):１~８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.００１收稿日期:２０２３－０４－２１基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１２００５００)ꎻ国家大宗蔬菜产业技术体系项目(ＣＡＲＳ－２３－Ａ０６)ꎻ国家自然科学基金项目(３１８７２９４９)作者简介:章力(１９９５ )ꎬ女ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:９８７７２５９９９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:黄泽军(１９７４ )ꎬ男ꎬ湖南郴州人ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｚｅｊｕｎ＠ｃａａｓ.ｃｎ利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代章力１ꎬ２ꎬ魏凯１ꎬ２ꎬ李珊珊１ꎬ宁宇１ꎬ路菲菲１ꎬ王孝宣１ꎬ国艳梅１ꎬ刘磊１ꎬ李鑫１ꎬ杜永臣１ꎬ李君明１ꎬ黄泽军１(１.中国农业科学院蔬菜花卉研究所/蔬菜生物育种全国重点实验室ꎬ北京㊀１０００８１ꎻ２.中国农业大学园艺学院ꎬ北京㊀１０００８１)㊀㊀摘要:转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良ꎬ其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节ꎮ本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ搜索结果ꎬ克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ꎮ利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ的编码区序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因的终止密码子前ꎬ形成一个嵌合基因ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ将嵌合基因插入到ｐＢＩ１２１双元载体ꎬ构建植物表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎬ利用农杆菌介导法转化番茄品种 ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ ꎬＴ０代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光ꎮＰＣＲ分子标记进一步验证发现ꎬ红色荧光种子萌发的幼苗均存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎬ表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为１００％ꎮ由此ꎬ本研究建立了一种利用ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎬ可以通过种子红色荧光可视化分析ꎬ简单快速㊁低成本地鉴定转基因番茄后代的方法ꎮ关键词:番茄ꎻ种子ꎻ红色荧光蛋白ꎻ油体蛋白ꎻ转基因鉴定中图分类号:Ｓ６４１.２:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－０００１－０８ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｏｍａｔｏＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＯｆｆｓｐｒｉｎｇｗｉｔｈＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭａｒｋｅｒｏｆＳｅｅｄｓＺｈａｎｇＬｉ１ꎬ２ꎬＷｅｉＫａｉ１ꎬ２ꎬＬｉＳｈａｎｓｈａｎ１ꎬＮｉｎｇＹｕ１ꎬＬｕＦｅｉｆｅｉ１ꎬＷａｎｇＸｉａｏｘｕａｎ１ꎬＧｕｏＹａｎｍｅｉ１ꎬＬｉｕＬｅｉ１ꎬＬｉＸｉｎ１ꎬＤｕＹｏｎｇｃｈｅｎ１ꎬＬｉＪｕｎｍｉｎｇ１ꎬＨｕａｎｇＺｅｊｕｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓａｎｄＦｌｏｗｅｒｓꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｉｏｂｒｅｅｄｉｎｇꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｏｍａｔｏ.Ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｏｆｆｓｐｒｉｎｇｉｓａｃｏｓｔ/ｌａｂｏｒ￣ｉｎｔｅｎｓｉｖｅａｎｄｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ.Ｗｅｃｌｏｎｅｄａｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｏｍａｔｏｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄａｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅｔｏｍａｔｏｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｂａｓｅＳＧＮ￣ＴＥＡ.ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅＴａｇＲＦＰｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎｏｆＳｌＯＬＥ１ｇｅｎｅｔｏｐｒｏｄｕｃｅａｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰꎬｗｈｉｃｈｗａｓｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏ￣ｍａｔｏｖａｒｉｅｔｙＭｏｎｅｙＭａｋｅｒｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｓｅｅｄｓｆｒｏｍｓｅｌｆ￣ｃｒｏｓｓｅｄＴ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｂｒｉｇｈｔｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｒｎｏｔｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ.ＦｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＰＣＲｍｏｌｅｃｕ￣ｌａｒｍａｒｋｅｒｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｇＲＦＰｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｒｉｓｉｎｇｆｒｏｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｅｄｓꎬｉｎｄｉｃａ￣ｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｐｒｏｇｅｎｙｂｙｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｔｓｅｅｄｓｔａｇｅｗａｓ１００％.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｔｈｉｓｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｉｍｐｌｅꎬｆａｓｔａｎｄｌｏｗ￣ｃｏｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｏｆｆｓｐｒｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｓｅｅｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＴｏｍａｔｏꎻＳｅｅｄꎻＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＯｌｅｏｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎꎻＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ㊀㊀转基因技术以及借助转基因的基因编辑技术ꎬ促进了植物基因功能研究ꎬ而且有助于改良植物性状和培育优良新品种ꎮ植物遗传转化后ꎬ转化植株及其后代中外源ＤＮＡ的检测是一个十分必要的环节ꎬ但工作量大㊁效率有待提高ꎮ在植物的遗传转化工作中ꎬ常借助选择基因和报告基因筛选转基因植株ꎮ以卡那霉素(ｎｐｔＩＩ)和潮霉素(ｈｐｔ)等抗生素或者ＥＰＳＰＳ和Ｂａｒ等除草剂抗性基因作为选择基因进行筛选[１－２]ꎬ不同植物材料对筛选剂所需的最适浓度差别较大ꎬ会出现假阳性结果ꎬ甚至有时会影响植株的正常生长ꎮ利用ＧＵＳ作为报告基因筛选时ꎬ需要对转基因植株组织进行ＧＵＳ染色检测[３]ꎬ会破坏植物组织ꎮＦＡＳＴ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｓｅｅｄｔｅｃｈｎｏｌ￣ｏｇｙ)是一种通过种子特异性启动子驱动荧光融合蛋白表达ꎬ利用种子荧光快速筛选转基因植株的方法ꎬ最早应用于模式植物拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)[４]ꎮ荧光蛋白是一类在特定波长下激发强烈荧光的蛋白质ꎬ可作为报告基因用于检测基因特异性表达和融合蛋白分子的定位㊁迁移㊁构象变化以及分子间的相互作用[５－９]ꎮ红色荧光蛋白(ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＲＦＰ)是从海葵(Ｄｉｓｃｏｓｏ￣ｍａｓｐｓｐ.)中分离出的与绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)同源的荧光蛋白[１０]ꎬ激发波长和发射波长均较长ꎬ其中ꎬＴａｇＲＦＰ的激发波长和发射波长分别为５５５ｎｍ和５８４ｎｍꎬ其亮度大约是ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白的３倍ꎬ具有高ｐＨ稳定性和荧光寿命长等特点ꎬ是目前所报道的相对较亮的单体红色荧光蛋白[１１]ꎮＦＡＳＴ技术将荧光蛋白作为可视化筛选标记直接鉴定转基因种子ꎬ方法简便且不会对植株产生破坏ꎬ能够降低大面积种植的成本ꎬ有效提高筛选效率[４]ꎮ油体蛋白(ｏｌｅｏｓｉｎ)是一类特殊的贮藏蛋白ꎬ有些油体蛋白在植物种子中特异表达ꎮ当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的Ｎ端或Ｃ端后不会影响其表达和定位ꎬ且融合蛋白非常稳定[１２－１３]ꎮ番茄(Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ)是一种具有重要经济价值的蔬菜作物ꎬ也是果实发育基础研究的模式植物ꎮ转基因技术和基因编辑技术已经大量应用于番茄基础研究和性状改良ꎬ然而传统的方法无法在种子阶段区分转基因和非转基因材料ꎬ转基因后代鉴定效率比较低ꎮ本研究参考ＦＡＳＴ技术ꎬ利用番茄种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１启动子驱动ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ利用种子红色荧光快速有效筛选番茄转基因后代ꎬ为后续的基因功能研究和性状改良带来便利ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与菌株番茄品种 ＲｉｏＧｒａｎｄｅ 来自美国俄亥俄州立大学ＥｓｔｈｅｒｖａｎｄｅｒＫｎａａｐ实验室ꎬ于２０２０年种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区温室ꎮ番茄品种 ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ (ＭＭ)的种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄遗传育种课题组扩繁保存ꎮ大肠杆菌ＤＨ５α和农杆菌ＧＶ３１０１购自上海唯地生物技术有限公司ꎮ１.２㊀番茄油体蛋白的鉴定与分析根据拟南芥油体蛋白研究结果[１４－１６]ꎬ从ＴＡＩＲ(ｔｈｅａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅ)数据库下载１７个拟南芥油体蛋白序列ꎮ以拟南芥油体蛋白序列为查询序列ꎬ采用ＢＬＡＳＴＰ(ｅ－ｖａｌｕｅ<１Ｅ－５)在茄科基因组数据库ＳＧＮ(ｓｏｌａｎａｃｅａｅｇｅ￣ｎｏｍｉｃｓｎｅｔｗｏｒｋ)中检索番茄油体蛋白ꎮ从ＮＣＢＩ数据库获得水稻(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ)油体蛋白序列ꎮ利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件进行番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白多序列比对ꎬ使用ＭＥＡＧ－Ｘ软件㊁采用最大似然法(ｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)构建油体蛋白序列的进化树ꎮ利用番茄果实发育成熟高分辨率时空转录图谱数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ｅｄｕ/)分析油体蛋白基因在成熟期果实组织的表达模式ꎮ１.３㊀ＴａｇＲＦＰ和番茄油体蛋白基因的克隆以中国农业科学院蔬菜花卉研究所张金喆老师惠赠的含红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ编码序列的番茄ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物ＺＰ３１１ꎬ利用高保真聚合酶预混液ＡｐｅｘＨＦＦＬＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ(艾科瑞生物)ꎬ对ＴａｇＲＦＰ进行ＰＣＲ扩增ꎮ反应程序为:９４ħ１ｍｉｎꎻ９８ħ１０ｓꎬ６０ħ１５ｓꎬ６８ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎮ以ＣＴＡＢ法[１７]提取的番茄品种ＲｉｏＧｒａｎｄｅ幼嫩叶片的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏｌｅ００２扩增番茄油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)全长序列ꎮ引物序列见表１ꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ采用ＥａｓｙＰｕｒｅ®ＱｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ(全式金)进行胶回收纯化ꎮＴａｇＲＦＰ和ＳｌＯＬＥ１的回收产物均与ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体(全式金)连接ꎬ转化至ＤＨ５α感受态细胞ꎬ挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ表１㊀基因克隆引物引物名称正向引物序列(５'－３')反向引物序列(５'－３')ＺＰ３１１ＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＯｌｅ００２ＧＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＴＡ１.４㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的构建根据ＳｌＯＬＥ１克隆载体序列和ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎬ采用软件ＣＥＤｅｓｉｇｎ设计无缝克隆引物(表２)ꎮ无缝克隆采用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(诺唯赞)ꎬ反应条件为３７ħ连接３０ｍｉｎꎮ以Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｌｉｎｅ００５进行反向ＰＣＲꎻ以ＴａｇＲＦＰ克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ００５扩增ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎮ分别对ＰＣＲ产物进行胶回收纯化ꎬ然后进行无缝克隆ꎬ将ＴａｇＲＦＰ编码序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面ꎬ构建ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎬ嵌合基因序列中仅保留１个终止密码子ꎮ使用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶对ｐＢＩ１２１植物双元表达载体(华越洋)进行双酶切ꎬ以克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０扩增ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因片段ꎬ胶回收纯化后与ｐＢＩ１２１双酶切产物进行无缝克隆ꎬ构建表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ表２㊀无缝克隆引物引物名称正向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)反向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)Ｌｉｎｅ００５ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴ￣ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴ￣ＧＡＴＧＴＧＩｎｓｅｒｔ００５ｔｃａｃｔｇｇａａｃｃｃａｔｃａｇａｃｔＡＴＧＡＧ－ＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡａａｇｔａｇａｇａｇｔａｇｃｇｃｔａｇｃＴＣＡＣＴＴ￣ＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＩｎｓｅｒｔ０１０ｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔＧＡＣＧＡＡＴＧ￣ＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａｔｔｃＣＧ￣ＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣ￣ＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧ１.５㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的遗传转化利用冻融法将表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ通过农杆菌介导法进行番茄ＭＭ子叶的遗传转化ꎮ遗传转化方案参照文献[１８]ꎬ将ＭＭ的种子消毒后置于１/２ＭＳ培养基ꎬ待子叶展开且真叶尚未长出时剪下子叶ꎬ在Ａ１培养基中暗培养２ｄ后进行侵染ꎬ侵染的子叶继续在Ａ１培养基中培养２ｄꎬ经Ａ２培养基诱导得到愈伤组织和分化的芽ꎬＡ３培养基分化培养得到小苗ꎬ最后由Ａ４培养基生根培养得到生根小苗后移栽至中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场玻璃温室ꎮ１.６㊀转基因番茄的ＰＣＲ检测和种子荧光鉴定提取转基因番茄植株的ＤＮＡꎬ根据表达载体中ＴａｇＲＦＰ两侧序列设计引物Ｏ＋Ｒ－７(Ｆ:ＧＧＴＡ￣ＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＧＧＡꎻＲ:ＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＴＣＧ￣ＴＡＧＣ)ꎬＰＣＲ检测Ｔ０代植株中是否插入ＴａｇＲＦＰ基因序列ꎮ将Ｔ０代阳性转基因植株自交授粉收获的干燥种子ꎬ置于徕卡体视荧光显微镜(ＬｅｉｃａＭＺ１０Ｆ)下进行荧光成像和拍照ꎮ挑选呈现荧光和无荧光的种子分别催芽ꎬ真叶长出后提取ＤＮＡꎬ进一步通过ＰＣＲ验证番茄转基因后代中是否含有ＴａｇＲＦＰ基因ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀番茄油体蛋白基因分析在ＳＧＮ数据库中检索到番茄中有９个油体蛋白编码基因ꎬ分别是Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０８６４９０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１９８２０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６０８４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６９２６０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０６６０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０７８１６０和Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０ꎮ在ＮＣＢＩ数３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代据库中检索到６个水稻油体蛋白编码基因:Ｏｓ０１ｇ０６４３９００㊁Ｏｓ０３ｇ４９１９０㊁Ｏｓ０４ｇ０５４６５００㊁Ｏｓ０５ｇ０５７６７００㊁Ｏｓ０６ｇ０４７３８００和Ｏｓ０９ｇ０３２４０００ꎮ为了明确番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白之间的亲缘关系ꎬ对番茄９个㊁拟南芥１７个和水稻６个的油体蛋白构建分子进化树(图１Ａ)ꎮ在进化树中ꎬ番茄油体蛋白基因Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０与拟南芥中的ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和ＡＴ５Ｇ５１２１０基因以及水稻的Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)和Ｏｓ０４ｇ０５４６５００(ＯｓＯＬＥ３)基因亲缘关系最近ꎮＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)是拟南芥种子中最丰富的油体蛋白[１９]ꎮ利用自身启动子分别驱动ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)㊁Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)基因与ＧＦＰ基因的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因拟南芥和水稻的种子呈现出绿色荧光[２０]ꎮ随后检索番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)ꎬ发现Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０和Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因在红熟期种子中的表达量居前三ꎬＲＰＭ值分别为２１１４.９４㊁１７１９.４１和１１８５.１５ꎮ由于Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０在番茄红熟期果实的其他组织中几乎不表达(图１Ｂ)ꎬ且其编码蛋白与拟南芥ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和水稻Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)蛋白序列相似性最高ꎬ因此ꎬ推测Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因(以下简称ＳｌＯＬＥ１)启动子可以驱动融合蛋白在番茄种子中表达ꎮ图１㊀番茄㊁拟南芥和水稻的油体蛋白进化树(Ａ)及番茄ＳｌＯＬＥ１基因在红熟期果实和㊀㊀总果皮的表达模式(Ｂ)(基因表达数据来自ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)２.２㊀种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ构建以番茄 ＲｉｏＧｒａｎｄｅ 的ＤＮＡ为模板ꎬ经引物Ｏｌｅ００２扩增得到长度为４００４ｂｐ的ＳｌＯＬＥ１基因全长片段(图２Ａ)ꎬ其中含启动子和终止子序列长度各约１.７ｋｂꎮ利用引物ＺＰ３１１扩增ＴａｇＲＦＰ编码区序列(７１５ｂｐꎬ图２Ｂ)ꎮＰＣＲ扩增片段分别连入ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体ꎬ测序后获得序列正确的克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１和Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰꎮ将质粒Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１通过反向ＰＣＲ线性化(引物Ｌｉｎｅ００５ꎬ表２)ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物(引物Ｉｎ￣ｓｅｒｔ００５ꎬ表２)进行无缝克隆ꎬ成功在ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面插入ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ获得重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎮ将ｐＢＩ１２１双元载体的ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双４山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀酶切产物ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物无缝克隆(引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０ꎬ表２)ꎮ无缝克隆产物转化大肠杆菌ＤＨ５αꎬ利用引物ＺＰ３１１进行菌液ＰＣＲ鉴定ꎬ以Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ有９份菌液扩增出条带ꎬ大小约为７１５ｂｐꎬ其中菌液ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ－１４的测序结果完全正确ꎬ成功构建种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ(图２Ｃ㊁图３)ꎮＭ:ＤＮＡ分子量参考ꎻ阳:Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒阳性对照ꎮ图２㊀ＳｌＯＬＥ１基因全长(Ａ)㊁ＴａｇＲＦＰ编码区片段(Ｂ)以及ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ菌液(Ｃ)的ＰＣＲ扩增图３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ表达载体示意图２.３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转基因阳性番茄植株获得将ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ以番茄ＭＭ的子叶为外植体进行侵染ꎬ经组织培养共获得４５个再生植株ꎮ以转基因植株的ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７对ＴａｇＲＦＰ基因进行ＰＣＲ检测ꎮ以ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ野生型ＭＭ为阴性对照ꎬ水为空白对照ꎬ结果(图４)显示ꎬ有８株Ｔ０代番茄植株的扩增产物与野生型ＭＭ一致ꎬ为单一条带ꎬ表明没有插入ＴａｇＲＦＰ基因ꎻ其余３７株均扩增出杂合条带ꎬ表明成功插入了ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ遗传转化效率达到８２.２２％ꎮ图４㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰＴ０代转基因植株的ＰＣＲ鉴定２.４㊀转基因番茄后代种子红色荧光观察及ＰＣＲ鉴定挑选９株生长健壮的ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ阳性转基因番茄幼苗ꎬ移栽至玻璃温室ꎬ振荡自交授粉ꎮ将Ｔ０代植株自交种子干燥后置于徕卡体视荧光显微镜下ꎬ以野生型ＭＭ的种子为阴性对照ꎬ分别在明场和荧光光源下检测ＴａｇＲＦＰ信号ꎮ结果(图５)显示ꎬ在明场下ꎬ野生型ＭＭ和转基因干燥种子颜色无明显差异ꎻ在荧光下ꎬ野生型种子均无红色荧光ꎬ转基因种子部分呈现明亮红色荧光ꎮ表明ＴａｇＲＦＰ可以作为一种标记筛选出转基因番茄后代中的红色荧光种子ꎮ５㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代图５㊀野生型ＭＭ和Ｔ０代转基因植株自交种子的ＴａｇＲＦＰ荧光检测㊀㊀为了验证通过种子红色荧光检测番茄转基因后代的准确性ꎬ进一步播种转基因植株的红色荧光种子和无荧光种子各９６粒ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７进行ＰＣＲꎬ鉴定后代植株是否存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎮ结果表明ꎬ９６株红色荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为杂合条带ꎬ表明含有ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ而９６株无荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为单一条带ꎬ表明不含ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎮ荧光种子和无荧光种子各１２粒萌发的幼苗ＰＣＲ检测结果如图６所示ꎬ表明通过种子红色荧光鉴定番茄转基因后代的准确率达１００％ꎮ图６㊀红色荧光(Ａ)和无荧光(Ｂ)种子的ＰＣＲ检测３㊀讨论与结论荧光蛋白有多种类型ꎬ其中ꎬ绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)㊁蓝色荧光蛋白(ＢＦＰ)㊁青色荧光蛋白(ＣＦＰ)和黄色荧光蛋白(ＹＦＰ)等[２１－２４]的发射波长局限在４４０~５２９ｎｍ[２５]ꎬ在细胞内成像时会激发某些内源物质产生荧光ꎬ对结果造成不同程度的干扰ꎮ本研究所使用的ＴａｇＲＦＰ的发射波长为５８４ｎｍꎬ细胞内成像背景低ꎬ更容易检测ꎮ通过ＰＣＲ分子标记检测发现ꎬ利用ＴａｇＲＦＰ作为筛选标记ꎬ区分转基因与非转基因种子的准确率可达１００％ꎮ此外ꎬ使用荧光蛋白标记筛选转基因种子时ꎬ可利用荧光种子分选设备进一步提高鉴定效率[２６－２７]ꎮ种子特异性表达启动子驱动荧光蛋白基因ꎬ可用于转基因种子的可视化鉴定ꎮ在拟南芥中使用种子储藏蛋白基因ｎａｐｉｎ启动子驱动荧光蛋白进行表达ꎬ可以在荧光显微镜下识别转基因种子[２８]ꎮ拟南芥和水稻油体蛋白基因ＡｔＯＬＥ１㊁Ｏｓ￣ＯＬＥ４与ＧＦＰ的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因种子呈现绿色荧光ꎬ从而实现快速简便鉴定转基因后代[４ꎬ２０]ꎮ本研究发现ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)是拟南芥ＡｔＯＬＥ１基因和水稻ＯｓＯＬＥ４基因的同源基因ꎬ而且在番茄种子中特异㊁高水平表达ꎮ利用Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因启动子驱动ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ成功实现了通过种子红色荧光快速简便鉴定转基因番茄后代的目的ꎮ由此推测ꎬ利用植物自身种子特异性启动子驱动油体蛋白与荧光蛋白融合基因的表达ꎬ可以应用于其他含油体蛋白种子植物的转基因后代鉴定ꎮ种子荧光标记系统已经逐步应用于基础研究６山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀和育种领域ꎮ基因编辑通常借助稳定的遗传转化ꎬ需要对阳性转基因植株和不含转基因成分的突变后代进行筛选ꎬ工作量大ꎬ费用高ꎮ玉米种子荧光报告系统辅助的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ基因编辑技术通过胚中的红色荧光标记准确鉴别转基因或非转基因籽粒ꎬ显著提高了基因编辑工作效率[２９]ꎮ水稻智能不育育种技术将育性恢复基因㊁花粉失活基因和种子特异启动子驱动的红色荧光蛋白基因串联ꎬ一起导入到水稻雄性不育突变体中ꎬ自交可产生无荧光的雄性不育种子和有荧光的可育种子[３０]ꎮ玉米雄性不育制种新技术也可根据红色荧光实现不育系和保持系种子的分选[３１]ꎮ利用单倍体诱导系的单倍体育种技术可以加快纯系选育进程ꎬ提高育种效率ꎮ然而单倍体诱导效率一般不高ꎬ鉴别也较为困难ꎮ利用基因编辑技术创制拟南芥㊁玉米和马铃薯等植物的单倍体诱导系ꎬ结合种子荧光标记ꎬ提高了单倍体鉴别效率[３２－３３]ꎮＺｈｏｎｇ等[３４]报道的番茄单倍体荧光鉴别技术体系中使用的是拟南芥ＦＡＳＴ￣Ｒｅｄ标记ꎮ本研究克隆了番茄自身的种子特异性表达基因ＳｌＯＬＥ１ꎬ并构建了ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎮ稳定遗传转化ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因的番茄种子在激发光照射下发出明亮的红色荧光ꎬ准确率可达１００％ꎮ该种子红色荧光标记筛选体系将有望应用于番茄基因编辑㊁智能雄性不育系创制和单倍体鉴别等领域ꎬ具有一定基础研究和育种应用价值ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＯｒｔｉｚＪＰꎬＲｅｇｇｉａｒｄｏＭＩꎬＲａｖｉｚｚｉｎｉＲＡꎬｅｔａｌ.Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅａｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｗｈｅａｔｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓ￣ｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１５ꎬ１５(１２):８７７－８８１. [２]㊀ＮａｋａｍｕｒａＳꎬＭａｎｏＳꎬＴａｎａｋａＹꎬｅｔａｌ.Ｇａｔｅｗａｙｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｔｈｅｂｉａｌａｐｈｏｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅꎬｂａｒꎬａｓａｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍ￣ｉｓｔｒｙꎬ２０１０ꎬ７４(６):１３１５－１３１９.[３]㊀ＳｈｉｖａＰｒａｋａｓｈＮꎬＢｈｏｊａｒａｊａＲꎬＳｈｉｖｂａｃｈａｎＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｏｒｎｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｃｏ￣ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００９ꎬ２８(１１):１６５５－１６６８. [４]㊀ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ａｒａｐｉｄａｎｄｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｓｅｅｄｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１０ꎬ６１(３):５１９－５２８.[５]㊀ＪａｃｈＧꎬＢｉｎｏｔＥꎬＦｒｉｎｇｓＳꎬｅｔａｌ.ＵｓｅｏｆｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ.(ｄｓＲＥＤ)ａｓａｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｇｅｎｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ２８(４):４８３－４９１. [６]㊀ＭｉｚｕｎｏＨꎬＳａｗａｎｏＡꎬＥｌｉＰꎬｅｔａｌ.ＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａａｓａｆｕｓｉｏｎｔａｇａｎｄａｐａｒｔｎｅｒｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏ￣ｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ４０(８):２５０２－２５１０.[７]㊀ＹａｒｂｒｏｕｇｈＤꎬＷａｃｈｔｅｒＲＭꎬＫａｌｌｉｏＫꎬｅｔａｌ.ＲｅｆｉｎｅｄｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤｓＲｅｄꎬａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｃｏｒａｌꎬａｔ２.０￣Åｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２００１ꎬ９８(２):４６２－４６７. [８]㊀ＪａｃｈＧꎬＰｅｓｃｈＭꎬＲｉｃｈｔｅｒＫꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍＲＦＰ１ａｄｄｓｒｅｄｔｏｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００６ꎬ３(８):５９７－６００.[９]㊀ＮｉｓｈｉｚａｗａＫꎬＫｉｔａＹꎬＫｉｔａｙａｍａＭꎬｅｔａｌ.Ａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏ￣ｔｅｉｎꎬＤｓＲｅｄ２ꎬａｓａｖｉｓｕａｌｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００６ꎬ２５(１２):１３５５－１３６１.[１０]ＭａｔｚＭＶꎬＦｒａｄｋｏｖＡＦꎬＬａｂａｓＹＡꎬｅｔａｌ.ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＡｎｔｈｏｚｏａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ１７(１０):９６９－９７３.[１１]ＭｅｒｚｌｙａｋＥＭꎬＧｏｅｄｈａｒｔＪꎬＳｈｃｈｅｒｂｏＤꎬｅｔａｌ.Ｂｒｉｇｈｔｍｏｎｏ￣ｍｅｒｉｃｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｎｅｘｔｅｎｄｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｉｆｅ￣ｔｉｍｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００７ꎬ４(７):５５５－５５７.[１２]ＲｏｏｉｊｅｎＧＪＨꎬＭｏｌｏｎｅｙＭＭ.Ｐｌａｎｔｓｅｅｄｏｉｌ￣ｂｏｄｉｅｓａｓｃａｒｒｉｅｒｓｆｏｒｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１３(１):７２－７７. [１３]ＨｕａｎｇＡＨ.Ｏｌｅｏｓｉｎｓａｎｄｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｓ[Ｊ].Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ１１０(４):１０５５－１０６１.[１４]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＨａｙａｓｈｉＭꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ｍｅｍｂｒａｎｅｄｙｎａｍ￣ｉｃｓａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｌｅａｖｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７６(１):１９９－２０７.[１５]ＣｈｅｎＫꎬＹｉｎＹＴꎬＬｉｕＳꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｓｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ.[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９４.[１６]ＹｕａｎＹＣꎬＣａｏＸＺꎬＺｈａｎｇＨＪꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｆｏｕｒｃｏｔｔｏｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｉｔｓｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｏｉｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ２１(１):５６９.[１７]ＤｏｙｌｅＪＪꎬＤｏｙｌｅＪＬ.ＡｒａｐｉｄＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｓｍａｌｌｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｅａｆｔｉｓｓｕｅ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎꎬ１９８７ꎬ１９:１１－１５.[１８]杨孟霞.利用基因编辑技术创制番茄雄性不育材料的研究[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０２０.[１９]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＴａｋａｈａｓｈｉＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｒｏｌｅｆｏｒｏｌｅｏｓｉｎｓｉｎｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｏｉｌｓｅｅｄｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００８ꎬ５５(５):７９８－８０９.[２０]ＳｈｉｍａｄａＴꎬＯｇａｗａＹꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＯｓＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｓｅｅｄｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ２０１１ꎬ６(１０):１４５４－１４５６.[２１]ＴｓｉｅｎＲＹ.Ｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆ７㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９９８ꎬ６７:５０９－５４４.[２２]ＰａｔｔｅｒｓｏｎＧＨꎬＤａｙＲＮꎬＰｉｓｔｏｎＤＪ.Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｅｃｔｒａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ１１４(５):８３７－８３８. [２３]ＲｉｚｚｏＭＡꎬＳｐｒｉｎｇｅｒＧＨꎬＧｒａｎａｄａＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｃｙａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｖａｒｉａｎｔｕｓｅｆｕｌｆｏｒＦＲＥＴ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ２２(４):４４５－４４９.[２４]ＧｒｉｅｓｂｅｃｋＯꎬＢａｉｒｄＧＳꎬＣａｍｐｂｅｌｌＲＥꎬｅｔａｌ.Ｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｎ￣ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ２７６(３１):２９１８８－２９１９４.[２５]樊晋宇ꎬ崔宗强ꎬ张先恩.红色荧光蛋白的光谱多样性及体外分子进化[Ｊ].生物化学与生物物理进展ꎬ２００８ꎬ３５(１０):１１１２－１１２０.[２６]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.一种用于荧光种子分选的光学装置:ＣＮ１１５１４４３３０Ａ[Ｐ].２０２１－０３－３０. [２７]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.荧光种子分选装置:ＣＮ２１４７１８４８２Ｕ[Ｐ].２０２１－１１－１６.[２８]ＳｔｕｉｔｊｅＡＲꎬＶｅｒｂｒｅｅＥＣꎬｖａｎｄｅｒＬｉｎｄｅｎＫＨꎬｅｔａｌ.Ｓｅｅｄ￣ｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｓｆｏｒｅａｓｙ(ｃｏ)ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｉｎＡｒａ￣ｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００３ꎬ１(４):３０１－３０９.[２９]ＹａｎＹＹꎬＺｈｕＪＪꎬＱｉＸＴꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｐｏｒｔｅｒ￣ａｓｓｉｓｔｅｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ６３(９):１６７１－１６８０.[３０]ＣｈａｎｇＺＹꎬＣｈｅｎＺＦꎬＷａｎｇＮꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒｈｙｂｒｉｄｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｕ￣ｓｉｎｇａｎｕｃｌｅａｒｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｇｅｎｅ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａ￣ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１６ꎬ１１３(４９):１４１４５－１４１５０.[３１]ＣａｉＤＲꎬＺｈａｎｇＺＧꎬＺｈａｏＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｈｙｂｒｉｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂａｓｅｄｏｎａｕｎｉｌａｔｅｒａｌｃｒｏｓｓ￣ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２３ꎬ６６(３):５９５－６０１.[３２]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＬｉＭＲꎬｅｔａｌ.ＡＤＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓＡｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｌａｎｔｓꎬ２０２０ꎬ６(５):４６６－４７２.[３３]ＺｈａｎｇＪＺꎬＹｉｎＪꎬＬｕｏＪＹꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｄｉｐ￣ｌｏｉｄｐｏｔａｔｏｔｈｒｏｕｇｈｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ａＢＩＯＴＥＣＨꎬ２０２２ꎬ３(３):１６３－１６８.[３４]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＷａｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎ￣ｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２２ꎬ２０(２):２５０－２５２.８山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀。