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熟读基因工程的基础知识（修订）基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（即只能识别某种特定的核苷酸序列，并且切割特定切点）（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体(1)作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）载体具备的条件：①能在受体细胞中大量复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（3）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（4）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：获取目的基因 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
生物技术制药试题及答案一、名词解释1. 生物技术（biotechnology）：有时也称为生物工程（bioengineering），是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，利用生物得体或其体系或它们的衍生物来制造人类所需要的各种产品或达到某种目的的一门新兴的、综合性的学科。
2．基因工程（gene enginerring）：是指在基因水平上的操作并改变生物遗传特性的技术。
即按照人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA 分子）在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录和表达的操作，也称DNA重组技术。
3．细胞工程（cell engineering）：是指在细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。
4．酶工程（enzyme engineering）：是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。
5．发酵工程（fermentation engineering）：是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段（主要是发酵罐或生物反应品的自动化、高效化、功能多样化、大型化）生产各种特定的有用物质；或把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。
由于发酵多与微生物密切联系在一起，所以又称之为微生物工程或微生物发酵工程。
6. 生物反应器（bioreactor）：主要包括微生物反应器、植物细胞培养反应器，动物细胞培养反应器以及新发展起来的有活体生物反应器之称的转基因植物生物反应器，转基因动物生物反应器等。
7. 转基因动物：是指在基因组中稳定地整合有导入的外源基因的动物。
8. 转基因植物：是指通过体外重组DNA技术将外源基因转入到植物细胞或组织，从而获得新遗传特性的再生植物。
基因工程在植物育种中的应用官玲(GUAN Ling)(莆田学院环境与生命科学系福建莆田351100)摘要：在现代生物技术中，基因工程作为一个重要的部分，已经在生产和生活等多方面起着重要的作用。
不断成熟的基因工程技术它解决了传统育种不能突破的问题，与传统育种方法相比, 基因工程技术具有独特优势可以定向修饰植物的某些目标性状并保留其它原有性状通过引入外来基因扩大基因库。
本文主要综述了基因工程在药用植物和花卉植物育种中的研究状况及对以后的发展现状进行的展望。
关键词：基因工程;植物育种;基因芯片技术;前景展望基因工程是指运用分子生物学技术, 将目的基因或DNA片段通过载体或直接导入受体细胞, 使受体细胞遗传物质重新组合, 经细胞复制增殖, 新的基因在受体细胞中表达, 最后从转化细胞中筛选有价值的新类型, 继而它再生为工程植株, 从而创造新品种的一种定向育种技术。
与传统育种相比, 植物基因工程具有以下特点植物基因工程是在基因水平上来改造植物的遗传物质, 更具有科学性和精确性,同时育种速度也大大加快能定向改造植物的遗传性状, 提高了育种的目的性与可操作性植物基因工程大大地扩展了育种的范围, 打破了物种之间的生殖隔离障碍, 实现了基因在生物界的共用性, 丰富了基因资源及植物品种。
1.基因工程技术在药用植物育种中的应用由于医药事业的快速发展, 野生药材资源已远远不能满足需要, 尤其是许多原料性药用植物资源已面临资源枯竭的威胁, 加之人工驯化和栽培的药用植物物种退化和濒危的问题极为突出。
根据这些中药资源的活性成分、生长规律、生产特性, 运用生物工程技术对其进行保存性研究, 从而保护濒危紧缺的药用植物资源.。
通过遗传转化, 将目的基因（如抗逆、抗病毒、抗虫、抗除草剂等相关基因）导入药用植物以改变传统遗传性状, 培育优良品种, 增强药用植物抗病毒、抗虫害、抗除草剂的能力, 利用植物生产异源蛋白及改变植物质量性状、保护和繁殖濒临灭绝的植物材料[1].1.1优良品种的培育刘建勋等[2]利用PCR 技术克隆出青蒿素生物合成途径中的关键酶基因和东北红豆杉中紫三醇生物合成途径中起限速作用的紫三烯合成酶基因, 该基因cDNA 片段由2586 个核苷酸组成, 将该cDNA 片段导入红豆杉细胞后, 影响紫杉醇含量。
转基因技术在水稻性状改良中的应用进展摘要综述了水稻转基因技术的发展、转基因技术在水稻中的应用以及外源基因在水稻中的遗传和鉴定，以期将转基因技术应用到环境科学领域，生产出安全无污染的稻米。
关键词水稻；转基因技术；性状改良中图分类号 q812 文献标识码a文章编号 1007-5739（2009）06-0131-02世界上有超过30%的人口以稻米为主食，随着世界人口的增加，对稻米的需求逐渐增加。
据统计，未来25年粮食产量必须增加60% 才可满足人口增长的需要[1]。
世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战。
因此，迫切需要采取措施增加水稻等农作物的产量。
随着分子生物学研究的不断发展，转基因技术在植物遗传育种和品种改良上得到了广泛应用。
自20世纪人类首次获得可育的转基因水稻以来，转基因技术在水稻品种改良上得到了广泛应用[2]。
该文综述了近年来水稻转基因技术的发展、应用进程。
1水稻基因转化方法基因转化的方法可分为2类：一是由载体介导的转化，主要的方法为农杆菌介导法；另一类是直接的基因转化，包括基因枪法、电击法、peg法、脂质体转化法和花粉管通道法[3,4]。
近年来，应用较多的为农杆菌介导法和基因枪法。
1.1农杆菌介导法农杆菌介导转化法是将外源基因插入农杆菌的质粒上，由载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中去。
农杆菌介导法在水稻上的遗传转化研究最早始于1986年，baba等用peg促进农杆菌原生质球与水稻原生质体融合的方法获得了水稻愈伤组织，但未获得转基因植株[5]。
随后，raineri等（1990）用粳稻的成熟胚与农杆菌共同培养获得了转基因愈伤组织，southern分析表明，t-dna已整合入基因组中，但未再生出转基因植株[6]。
chan等首次报道用农杆菌转化水稻根系外植体（1992）和未成熟幼胚（1993）得到可育转基因水稻，southern blot分析表明，t-dna上的基因可传递给后代[7，8]。
基因工程一基因工程的概念及基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)①本质：蛋白质。
②来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
③作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
④结果：产生黏性末端或平末端。
例：如下图所示，Eco RⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是—CCCGGG—，切割位点在C和G之间；说明限制酶具有特异性。
限制酶为何不切割自身DNA?提示限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。
限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
(3)载体①载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
②常用载体：质粒。
其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
③质粒a．概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
b．特点：能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
二基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。
获取方法⎩⎪⎨⎪⎧人工合成⎩⎪⎨⎪⎧利用PCR 技术扩增(1)从基因文库中获取①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，可分为基因组文库和部分基因文库(如cDNA 文库)。
cDNA 文库的构建某种生物的单链mRNA反逆↓转录酶 单链互补DNA ↓DNA 聚合酶 双链cDNA 片段 ↓与载体连接导入受体菌中储存 ↓cDNA 文库人工合成的两条DNA 片段(引物1，引物2)当温度上升到90～95_℃时，双链DNA 解旋为单链温度下降到55～60_℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合70～75 ℃时，Taq 酶从引物3′端开始进行互补链的合成DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA ，而只能从3′端延伸DNA 链，即DNA 的合成方向总①前提条件：核苷酸序列已知，基因比较小。
抗除草剂基因工程与抗除草剂 转基因小麦的研究进展
1 抗除草剂基因工程研究概况 通过化学方法来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分, 除草剂的年产量已居农药之首, 据估计美国每年用在除草剂上的费用大约是50 亿美元。由于除草剂作用机理是影响植物生理生化过程, 如光合作用、氨基酸的合成等, 因此除草剂在消灭杂草的同时也对作物具有伤害作用, 这就限制了除草剂的应用。以往解决除草剂对作物伤害问题主要是: (1) 应用对作物伤害小的除草剂和施用方法。(2) 通过杂交育种, 把和栽培作物亲缘关系近的野生植物对除草剂抗性的基因引入到栽培品种。由于作物栽培种和近缘种通常不具备有抗除草剂的特性, 这种育种方法存在局限性。随着生物技术的发展, 目前, 用遗传工程方法来培育抗除草剂的作物品种已成为人们控制杂草的主要方法。近10 余年来, 随着对除草剂作用机制的深入了解以及基因分离转化技术的迅速发展, 植物抗除草剂基因工程取得了较大的成功, 已从链霉菌、突变的烟草等生物体分离出抗除草剂基因。 1.1 抗除草剂基因工程的技术策略 目前, 抗除草剂基因工程主要采取两种策略: (1) 修饰除草剂作用的靶蛋白使其对除草剂不敏感或过量表达, 作物吸收除草剂后仍能进行正常代谢作用。 草甘膦(Glypho sate, 商品名Dupound) 是一种非选择性, 广谱的高效、低毒有机膦除草剂。它特异性地抑制植物和微生物芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 合成途径中52烯醇丙酮酸莽草酸232磷酸合酶(5-eno lpyruvyl-sh ik imate-3-pho sphate synthase, EPSPS) 的活性, 导致芳香族氨基酸缺乏, 莽草酸积累, 最终导致细胞死亡。1985 年Camai 等[1, 2 ]首先从鼠伤寒沙门氏菌中筛选出了抗草甘膦的突变菌株, 随后分离出突变基因( aroA 基因) 并将此突变的aroA 基因转入烟草细胞获得第一个抗草甘膦转基因作物。后来F illat t i 等[3 ]将此基因转入番茄, 获得转基因番茄。1986 年Shah 等[4 ]培育并筛选出具有对
草甘膦抗性的矮牵牛细胞系M P42G, 能超量产生EPSPS 合成酶, 并分离出EPSPS 合成酶基因, 转入矮牵牛属的叶圆片获得转化愈伤组织, 其EPSPS 合成酶的活性提高了40 倍。目前已获得抗草甘膦的烟草[2, 5 ]、矮牵牛、番茄、大豆、小麦[7 ]等。 磺酰脲类除草剂和咪唑酮类除草剂, 都是通过抑制支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸) 合成中乙酰乳酸合酶(aceto lactate synthase, AL S) 来表现除草剂的作用。1988 年, Haughn 等[8 ]通过转基因手段已将拟南芥植株的AL S 的突变基因引入烟草, 这一转基因植物产生了对除草剂的抗性。对抗绿磺隆转基因作物研究也较多[9～ 11 ] , 我国学者李国圣等[12, 13 ]将拟南芥的AL S 基因导入玉米, 已进入田间试验。 (2) 引入酶或酶系统, 在除草剂发生作用前将其降解或解毒。草丁膦(Pho sph ino th ricin) 是非选择性的广谱除草剂Basta 的活性成分。 草丁膦除草作用机理是抑制植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(GS) , GS 可以解除硝酸盐还原、氨基酸降解及呼吸中释放出的氨的毒性。虽然草丁膦抑制细菌、植物及哺乳动物的GS, 但它不能进入哺乳动物的血液和脑组织, 因此草丁膦对哺乳动物是安全的[14 ]。乙酰CoA 转移酶(acetyl CoAtransferase) 催化草丁膦的自由氨基乙酰化, 从而使除草剂草丁膦失活。1987 年Thomp son 等[15 ]从链霉菌(S trep tom y ces hy g roscop icius) 分离出bar 基因615 bp , 编码草丁膦乙酰CoA 转移酶(PA T )。另外来自S trep tom y cesv irid och rom og enes 的pat 基因约113 kb, 编码PA T 的基因在其中的BgË 2SstÊ 片段上[16 ]。
两种基因产物有相似的催化能力, 氨基酸序列86% 同源。PA T 表达量占总可溶性蛋白的010001% 时足以使植物产生抗草丁膦抗性。目前已经将bar 基因转入多种作物如烟草[17 ]、番茄[18 ]、马铃薯[19 ]、水稻[20～ 23 ]、小麦[24～ 27 ]等。 溴苯腈(B romoxyril) 是除草剂Buct ril 的活性成分, 抑制光系统Ê 电子传递, 它对于生长素2, 42D 不能控制的杂草特别有效。从土壤细菌臭鼻杆菌(K lebsiel la oz aenae) 中分离出溴苯腈降解基因bxn, 编码腈水解酶, 该酶把溴
苯腈转变为无活性产物3, 52二溴242羟基苯甲酸。另外, gox 基因编码的草甘膦氧化还原酶, 能把草甘膦降解成无毒成分。tfDA基因, 编码2, 4-D 单氧化酶, 能将2, 4-D 降解为非光和毒性的2, 4-二氯苯, 也在选育抗性作物中获得成功表达。 一般认为, 引入外源酶使除草剂失活的策略比靶位点突变的策略优越。因为靶标酶或靶标蛋白质的过量产生会给作物造成代谢负担, 对作物的生长和产量不利, 而且靶酶的改变, 其异构酶的活性通常会降低, 甚至对转基因作物有害。外源酶的引入负效应要小, 并且降解系统产生的对除草剂的抗性专一性强、效率高。 1.2 抗除草剂基因工程的应用
1.2.1 将除草剂基因导入作物中培育抗除草剂作物 抗除草剂转基因作物的研究主要集中于美国各大农药公司或与有关的遗传单位合作研究开发, 因为通过对除草剂作物品种的研究, 一方面扩大公司除草剂的销售, 另一方面又可出售种子。目前国外转基因抗除草剂作物商品化的有: 抗草甘膦的大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜, 抗草丁膦的大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜、水稻, 抗咪唑啉酮的玉米、油菜、甜菜、水稻, 抗磺酰脲类的大豆、棉花, 抗拿扑净玉米, 抗溴苯腈的棉花、烟草。我国从事抗除草剂基因工程研究的单位有多家, 获得的抗除草剂转基因作物有: 抗Basta 水稻[22 ]、小麦、烟草、油菜、芝麻等, 抗阿特拉津大豆, 抗溴苯腈油菜、小麦, 抗草甘膦小麦。
1.2.2 利用抗除草剂基因作为遗传转化的选择标记基因 将抗除草剂基因与其它目的基因(如抗虫、抗病基因) 构建到同一载体上, 导入作物中, 转化体若表现出对除草剂的抗性, 说明抗除草剂基因整合到作物基因组中, 也间接说明目的基因也整合到作物基因组中。bar 基因是迄今为止用得最多的一个抗除草剂选择标记基因, 已成功地用于小麦、水稻[20, 21 ]、玉米、大麦、油菜等作物的转化。另外, 作为选择标记基因, 抗草甘膦的aroA 基因、抗溴苯腈的bxn 基因和抗绿磺隆的csrl 基因等也成功地用于不同作物的遗传转化。
1.2.3 抗除草剂基因在作物杂种优势及其它方面中的应用 利用杂种优势是提高作物产量与质量最为有效的途径之一。在创造作物雄性不育工程植株中, 若转化基因不是单基因纯合显性表现时, 则其与保持系的杂交后代发生分离现象, 一些植株雄性不育, 一些则雄性可育。如将抗除草剂基因与不育系基因构建在一起, 一并导入植株, 培育出抗除草剂的不育系, 只要在苗期喷施除草剂, 没有转化的植株或假杂种就会死去, 剩下的就是不育系或真杂种。例如曹光诚、傅荣昭等将抗除草剂基因bxn 或bar 与雄性不育基TA29-barnase 串联在一起构建到植物表达载体上, 导入作物, 实现了作物转基因雄性不育材料的保持。另外, 将抗除草剂基因转移到恢复系中, 培育出带有纯合抗性基因的恢复系。这样在制种过程中产生的假杂种, 就可以通过使用除草剂除去。中国水稻研究所黄大年等成功地用基因枪法将bar 基因导入三系杂交水稻或二系杂交水稻的恢复系, 使恢复系获得抗除草剂基因, 具备抗除草剂特性, 再用所得到的转基因恢复系与三系不育系或二系不育系杂交, 生产杂交水稻种子。这样就解决了杂交水稻种子纯度不够所致的生产上无法使用的问题, 并能够及时清除假杂种植株。 1.3 抗除草剂基因工程应注意的问题 在进行抗除草剂基因工程时, 不仅要考虑到转基因食品对人体的安全, 而且要注意抗除草剂基因工程特有的问题:(1) 在抗除草剂转基因研究中, 所抗的除草剂对环境的问题。所抗的除草剂首先应是广谱、低毒、低残留、低挥发性及环境“温和”型, 并且不易在土壤中淋溶, 以免进入地下水和土壤的底土。(2) 抗除草剂基因所带来的作物生长势和产量下降的问题。应选择编码使除草剂失活的外源酶基因(如bar 基因) , 因为引入编码靶标酶或靶标蛋白质的基因(如EPSPS 基因) 会产生过量的酶或蛋白给作物造成代谢负担, 对作物的生长和产量不利。(3) 抗性作物品种使用过程中与杂草可能发生自然杂交的遗传问题。当杂草和除草剂抗性作物亲缘关系接近时, 通过自然杂交, 基因可以从作物流入亲缘关系近的杂草。因此在作物种植区如果存在有亲缘关系近的杂草, 则不应种植抗除草剂品种。(4) 抗除草剂作物的应用可能导致单一作物品种的连作, 降低了对除草剂敏感的作物与这些转基因作物实行轮作和混作的可能性。这就可能导致农业生态系统中作物种植多样性的匮乏, 从而为那些生长不受遏制的杂草、害虫和疾病提供了最佳环境。而且通过增强除草剂的有效性,抗除草剂作物将会进一步降低作物种植的多样性, 反而有利于杂草群落的形成和发展, 有利于对广谱除草剂产生适应的竞争性物种快速进化。另外, 抗除草剂作物本身成为杂草的问题。如在收获过程中掉落在土壤中的籽粒, 可能成为轮作中后茬作物的田间杂草。
2 抗除草剂转基因小麦的研究进展 转基因植物自20 世纪80 年代开始研究, 如何将转基因技术应用于小麦、水稻、玉米等农作物一直是人们努力的目标之一。要实现这一目标, 首先需要建立高效、可靠、重复性好的基因转化系统。在植物基因转化系统研究方面, 由于禾谷类作物是单子叶植物, 不是土壤农杆菌的天然寄主, 所以长期以来农杆菌介导转化只是局限在双子叶植物范围内。近年来,人们对农杆菌转化植物细胞的原理及步骤进行了系统研究, 发现农杆菌确实能侵染许多包括重要禾本科植物在内的单子叶植物, 如水稻、玉米、大麦、小麦。但总体上来说, 单子叶植物在遗传转化效率落后于双子叶植物。在禾谷类作物中, 由于小麦原生质体培养困难, 因此小麦相对于其它作物(如水稻、玉米、甘蔗等) 又进一步表现出滞后性, 直到1992 年V asil才首次报道了抗除草剂转基因小麦植株的再生。近几年来, 随着组织培养、基因表达系统、转化方法的进步, 以及抗除草剂基因的发现和分离,
