食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

食品中金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的检测分析发表时间：2018-01-22T15:02:36.540Z 来源：《中国蒙医药》2017年第16期作者：肖慧[导读] 通过PCR检测方法对速冻食品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测，能够有效检测出起始菌落数量相对较低的菌落。

湖南省怀化市辰溪县疾病预防控制中心 419500【摘要】目的：对食品中的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行检测，分析其检测效果。

方法：对速冻食品通过PCR检测的方式进行检测，分析检测结果。

结果：PCR检测方法能够有效检测出速冻食品中的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，效果显著。

结论：通过PCR检测方法对速冻食品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测，能够有效检测出起始菌落数量相对较低的菌落，该方法值得在食品检测中推广使用。

【关键词】金黄色葡萄球菌；沙门菌；食品；检测；PCR检测伴随着我国经济的发展进步，生活水平也在逐步提升，饮食习惯也在发生改变。

目前速冻食品由于其营养丰富和方便快捷的特点受到了众多消费者的广泛欢迎，在我国食品工业中逐渐占据了重要的地位[1-2]。

但是，在速冻食品的食品检测中，能够发现一些食源性致病菌，最具有代表性的就是沙门氏菌和金黄色葡萄，这类细菌会影响速冻食品的安全，引发众多的人类疾病，必须对其投入足够的重视[3-4]。

为了有效保证速冻食品的安全，减少由于食品导致的人类疾病，必须及时采取确实有效的致病菌检测方法对食品安全进行检测，PCR 检测技术就是其中具有代表性的一种检测方法[5-6]。

1.一般资料与方法1.1一般资料材料和试剂：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、粪肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、坂崎肠杆菌、微球菌等供试菌群。

专用的细菌培养基。

细菌DNA提取试剂盒、引物合成、多重PCR试剂盒。

仪器和设备：高速离心机、漩涡混合器、电泳仪、凝胶图像分析仪、紫外分光光度计、梯度PCR扩增仪。

1.2方法通过查阅相关的文献研究成果，为多重PCR检测提供靶基因，包括金黄色葡萄球菌的nuc基因以及沙门氏菌的invA基因，二者引物设计如下表1所示。

熔解曲线结合RT-PCR在餐饮食品中对5种致病菌的检测YAO Yan-ling;LIU Luo-qiang;GUAN Jia-li【摘要】建立快速检测餐饮食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7及副溶血性弧菌5种致病菌的实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR).通过增菌时间的比较,调整RT-PCR反映体系中的退火温度,建立5种致病菌相同的检测体系.试验结果表明,5个目标菌达到检测灵敏度的最短增菌时间范围为2 h～8 h,5种致病菌的试验灵敏度范围为7.4×10 CFU/mL～2.4×103 CFU/mL.5种目标菌的熔解温度Tm值分别为沙门氏菌87.32℃,金黄色葡萄球菌79.57℃,单核增生李斯特氏菌82.02℃,大肠埃希氏菌O157:H782.24℃,副溶血性弧菌87.15℃.试验建立的RT-PCR快速检测反应体系,与常规微生物检测方法相比,有效地缩短了检测时间,且灵敏度与特异性均能满足检测要求.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(P142-148)【关键词】实时聚合酶链式反应;熔解曲线;沙门氏菌;金黄色葡萄球菌;单核增生李斯特氏菌;大肠埃希氏菌O157:H7;副溶血性弧菌【作者】YAO Yan-ling;LIU Luo-qiang;GUAN Jia-li【作者单位】;;【正文语种】中文近年来，以门店形式现制现售的食品越来越受到年轻人的喜爱，包括外卖、饮料、甜品等。

但是，由于现制食品涉及到的原料新鲜度、保存条件及现场制作的环境、保藏条件、保存时间及人员操作等均对最终产品具有潜在的病原微生物污染风险。

该类食品现制现售、流通较快，对微生物检验数据出具的时间要求较为紧迫。

目前，对于食品中微生物检测主要采用GB 4789系列标准，而且我国尚未对现制现售食品发布相关检验标准，采用传统微生物检测方法，步骤涉及分离、纯化、生化鉴定等，方法上显得冗长，时间上显得滞后，不利于安全监管，也不利于应对大型集会及突发性食品安全事件。

微流控芯片-激光诱导荧光快速检测4种食源性致病菌李永新;黎源倩;渠凌丽;何成艳【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2008(36)12【摘要】建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法.根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23s rDNA IGs)基因、沙门菌的 invA 基因、大肠杆菌0157:H7 的 rfb0157 基因和志贺菌的 ipaH 基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重 PCR 扩增,采用微流控芯片-激光诱导荧光检测食品中4种常见致病菌的多重 PCR 扩增产物.优化了多重 PCR 扩增和微流控芯片电泳分离的实验条件.当芯片电泳的筛分介质 HPMC-50 浓度为2.2%、溴乙锭(EB)含量为3.75μmoL/L、电场强度为120 V/cm 时,pUC Mix DNA Marker-8和待测致病菌的多重PCR扩增产物可以实现基线分离,600 s内即可完成上述4种致病菌的同时检测,迁移时间的日内相对标准偏差为0.74%～2.09%.本方法能够检出1×102 cfu/mL的副溶血弧菌、沙门菌、大肠杆菌0157:H7和志贺菌.方法特异性高,所设计的引物在10种非目的菌株体系中均未见扩增的片段.将本法应用于食品中上述致病菌的测定,获得了满意的结果,为常见食源性致病菌的快速检测提供了一种新的可靠分析手段,对保障食品安全具有重要的现实意义.【总页数】5页(P1667-1671)【作者】李永新;黎源倩;渠凌丽;何成艳【作者单位】四川大学华西公共卫生学院卫生检验教研室,成都,610041;四川大学华西公共卫生学院卫生检验教研室,成都,610041;四川大学华西公共卫生学院卫生检验教研室,成都,610041;四川大学华西公共卫生学院卫生检验教研室,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】O65【相关文献】1.多响应曲面优化-毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测食源性致病菌 [J], 渠凌丽;黎源倩;郑波;何成艳;何玲;李永新2.应用液相芯片技术快速检测常见食源性致病菌的研究 [J], 于金辉3.激光诱导荧光光谱快速检测食源性致病菌 [J], 刘宇;李增威;邓志鹏;张庆贤;邹立扣MP微流控芯片快速检测三种食源性致病菌 [J], 鞠鹤鹏;戴菁;谢逸欣;郑婕;陈丽璇;陈洁;梁卫根5.用于3种食源性致病菌核酸提取的微流控芯片制备 [J], 曹宁;申炳阳;喻梓瑄;占太杰;周新丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

多种食源性致病菌快速检测方法作者：刘晓来源：《食品界》2016年第08期食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，每年向卫生部上报的食物中毒人数逐年递增，且大部分是由食源性致病菌引起的。

据世界卫生组织估计，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。

由此可见，食源性疾病与食品污染问题已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题。

因此，建立科学、准确、全面的食源性致病菌检测体系，是保障食品安全的重要手段，对预防和控制微生物性食物中毒事件起着重要的作用。

目前对这些食源性致病菌的检测，主要依靠常规的细菌学培养方法，一般需4～7d，操作繁琐，费时耗力，检验的准确度不高，在检测速度、敏感性与特异性等方面也有局限性。

随着微生物学的快速发展，食品微生物学检验中引入了越来越多的新技术，有关食源性致病菌检测的免疫磁性分离法、酶联免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛的应用其中以高通量、灵敏、特异、适用范围广和低成本为特点的快速检测方法受到越来越多的关注，而在这些方法中又以DNA检测为基础的各种分子生物学方法应用尤为广泛。

同时，常规培养检测方法、基于免疫反应的检测方法等检测手段也在进一步地完善和改进。

本文通过探讨目前常用食源性致病菌检测方法，对不同方法的优缺点进行阐述和分析。

常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，食品中致病菌的常规培养检测方法灵敏、稳定、准确，并且检测结束后可获得目标致病菌，供后续研究，例如通过对从污染食品中检出的致病菌和从临床病人中分离的致病菌进行分析比较，并结合流行病学调查，可以揭示污染食品和病人之间是否存在关联，即是否是由于食用了污染食品而导致的临床病例的出现，从而为食品安全预警提供实验室的支持。

正是由于这些优点，所以截至到目前，世界上很多国家仍将常规培养检测方法列为食品微生物检测的金标准，例如我国的国家标准GB4789食品微生物检测系列，美国食品药品管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）的细菌分析手册（BacteriologicalAnalyticalManual，BAM）等等。

食品微生物检测技术食品微生物检测技术是指利用先进的科学手段对食品样品中的微生物进行检测的方法。

近年来，随着人们对食品安全越来越关注，食品微生物检测技术成为了食品安全保障的一项重要措施。

一、食品微生物检测技术的意义食品微生物检测技术的主要作用是检验食品样品中是否存在病原微生物，如沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，这些病原微生物会对人体造成不同程度的健康威胁。

此外，食品微生物检测技术还能检测食品样品是否存在有害微生物，如霉菌、酵母菌等，这些微生物虽然不致病，但会影响食品的质量和口味。

二、常见的微生物检测技术1.培养法培养法是食品微生物检测的一种常见方法。

此方法将食品样品在不同温度、氧气、湿度等环境条件下分别培养，以便于检测芽孢、大肠杆菌和霉菌等微生物。

这种方法的缺点是需要较长的时间，有时需要一周或更长时间才能得到结果。

2.快速检测法快速检测法是在研究了微生物的生长特征、代谢特性等基础上发展而来的新型检测技术。

这种方法通常不需要预处理，能够在较短的时间内进行检测，如蛋白芯片技术、荧光定量PCR 等。

这种方法的优点是速度快、效率高，但成本较高。

3.基因序列分析法基因序列分析法是通过测定微生物的特定基因序列，对食品样品中的微生物进行鉴定。

这种方法具有高度的特异性和准确性，但需要高度的技术水平和设备支持。

三、检测技术的选择针对不同微生物，不同检测目的和不同检测场景，需要选择合适的检测技术。

传统培养法可以检测多种微生物，但速度较慢，不适用于针对特定微生物的快速检测。

快速检测法速度快，但适用范围相对较窄，仅适用于某些特定种类的微生物或某些特定的检测要求。

基因序列分析法适用范围更广，但操作复杂，检测设备曾显得较为昂贵。

四、检测技术在食品安全中的应用食品微生物检测技术在食品安全保障中发挥了重要的作用。

它能够有效地检测食品中的病原微生物和有害微生物，保障了人民群众的口腹安全。

同时，也使得食品业者更加明确了食品安全的责任，强化了其对自身产品的质量管理，维护了企业的声誉和品牌形象。

分子生物学技术在食品安全检测中的应用食品安全一直是人们关注的焦点之一。

随着科学技术的不断发展，分子生物学技术作为一种高效、精准的检测手段，在食品安全领域发挥着越来越重要的作用。

本文将着重介绍分子生物学技术在食品安全检测中的应用，并探讨其优势和挑战。

一、PCR技术在食品安全检测中的应用聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，它能够快速复制少量DNA片段，并检测其中是否存在特定的基因序列。

在食品安全检测中，PCR技术被广泛应用于基因改造食品的检测、病原微生物的鉴定以及农药残留的测定等方面。

首先，PCR技术在基因改造食品的检测中发挥着重要作用。

通过PCR技术可以快速准确地检测食品中是否存在转基因成分，并判定其含量是否超过标准限制。

这对于保证消费者的食品安全，维护市场秩序具有重要意义。

其次，PCR技术在病原微生物的鉴定中具有显著优势。

传统的微生物检测方法需要耗时且操作繁琐，而PCR技术则可以在短时间内迅速检测出食品中的致病微生物，比如沙门氏菌、大肠杆菌等，为食品安全控制提供了可靠的手段。

最后，PCR技术还可以应用于农药残留的测定。

农药残留是常见的食品安全隐患之一，传统的检测方法往往耗时且效果不理想。

而PCR技术通过检测食品中农药代谢产物的DNA序列，可以实现农药残留的快速检测和定量分析，为食品安全监管提供了科学依据。

二、全基因组测序技术在食品安全检测中的应用全基因组测序是一种万能的分子生物学技术，它可以对样品中的全部DNA进行测序，并得到该样品的全部基因信息。

在食品安全检测中，全基因组测序技术被广泛用于微生物群落分析、食品溯源和品种鉴定等方面。

微生物群落分析是食品安全领域的热点研究方向之一。

传统的微生物检测方法只能检测出特定的微生物，而无法全面了解食品中微生物的种类和数量。

而全基因组测序技术可以对食品中的微生物进行全面的基因信息测定，从而准确鉴定微生物种类和数量，为食品安全评估提供更加可靠的数据支持。

简述食品中大肠杆菌的快速检测方法相关研究进展摘要：大肠菌群的快速检测是食品、药品卫生监督检验迫切需求，本文从免疫学技术，酶学的技术，分子生物学技术，传统检测方法改进技术，物理化学技术，其它技术方面对大肠菌群快速检测方法研究进展进行综述，并对其存在问题及应用前景进行分析。

这些方法各有优缺点，免疫学技术和分子生物学技术灵敏度高，但假阳性率高，无法区分死活菌；酶学的技术和物理化学技术特异性好，省时省力，但这些方法成本较高，不适合基层实验室使用；传统检测方法改进技术结果准确，但费时费力。

因此，仍需要发展一种新的方法解决所存在的问题。

要真正实现大肠菌群的快速检测还需要不断进行科学研究，以寻找一种能够真正实现成本低、灵敏度好、准确性高并且检测速度快的更合适的方法。

关键词：食品；大肠菌群；快速检测；研究1引言大肠菌群为一群在37C、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌的统称。

这些细菌多存在于温血动物粪便中，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然存在的主要原因。

因此，大肠菌群被国际上公认为检测各种水质、医药及食品在流行病学上安全性的指示菌。

如果检测到大肠菌群呈阳性结果，那么便表明食品、药品或者水质存在大肠菌群，已经被粪便污染。

大肠菌群的数量与受到的污染程度成正比，数量越多，受污染越严重。

目前我国国家标准主要用多管发酵法来检测大肠菌群多管发酵法作为一种传统的检测方法已沿用多年，其准确性、权威性无可质疑，但该方法费时费力，而且检测所需的费用较高，已无法满足人们对食品、药品安全现场监测的要求，因此，现在食品、药品卫生监督检验迫切需要一种更加有效、快速的大肠菌群检测方法。

近年来，世界各国针对大肠菌群的快速、定量检测技术都进行了专门的研究，本文综述了大肠菌群快速检测技术的研究进展，并对其存在问题及应用前景进行分析。

2大肠菌群主要的快速检测方法2.1免疫学技术免疫学方法检测原理是依据抗原和抗体特异性反应。

PCR技术在食品检测中的应用摘要：改革开放以来，我国的经济快速发展，人民生活水平不断提高，人们越来越关注食品安全问题。

在加入世贸组织之后，国际上也对我国食品出口的质量进行严格把关。

自PCR技术问世以来，因其灵敏、快速、操作简便的优点，在食品检测领域得到广泛应用。

近年来，关于PCR改进技术在食品检测中的应用研究越来越多。

本文主要就PCR技术在食品检测中的应用予以讨论，旨在为相关工作者提供有益借鉴。

关键词：PCR技术；食品检测；应用前言在我国经济取得重大成就的大环境下,人们对于生活质量有了更高的要求,尤其是食品安全方面,更是受到广泛关注。

食品安全问题对人们的身体造成严重破坏，甚至会威胁人们的生命，因此，对食品中的一些微生物以及病菌的检验是现实的必然需求。

检测食品安全的技术对于防止食品中的病菌以及微生物进入人体有着重要作用。

现在检测食品安全技术最主要的是PCR技术，本文从该技术的定义出发，分析了它在食品安全检测中的作用。

1.PCR技术聚合酶链式反应技术叫PCR技术，运用该技术在体外就能将指定基因以及DNA序列迅速扩增，最先应用此技术是基因克隆以及检测转基因，随着人们对食物微生物遗传性质的不断了解，进一步明确大部分致病菌的遗传条件，PCR技术也逐渐应用在食品检测中。

2.常规PCR检测技术在食品检测中的应用常规PCR检测技术于1985年被发明，最早应用于基因克隆和转基因检测，由于其精确、快速等特点，近年来其在食品检测中的应用也越来越广泛，主要包括食品中成分种类的检测、食品中有效成分的检测、转基因食品的鉴定和食源性致病菌的检测。

常规PCR检测技术可以用于水体微生物的检测。

近几年来，人们广泛关注病原微生物，由此，PCR技术也逐渐应用于水体微生物的检测，尤其是对生活水的微生物检测。

常规PCR检测技术还可以用于食品样品中致病菌的检测，主要有两个步骤。

第1步：通过离心或者过滤的方法从样品中获得细菌细胞，抽提DNA；第2步：将细胞裂解，进行核酸纯化，使其符合PCR的技术应用标准。

86·FOOD INDUSTRY分析 检测　陈文财 惠州市食品药品检验所食品中沙门氏菌的快速检验方法泛用于遗传病诊断和微生物检验中。

（我个人认为沙门不会用）荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检验法基于沙门氏菌ｆｉｍＹ基因序列，进行引物和探针的设计，利用基因重组技术对检测的定量标准品进行构建，可借助荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法对沙门氏菌进行检测。

该方法操作简单、检验快速、适用范围广，在临床诊断、商品检验、食品卫生监管等领域均有运用。

多重ＰＣＲ快速检验法多重ＰＣＲ快速检验法基于质粒毒力基因ｓｐｖＣ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ、ｆｉｍＡ、致病基因ｉｎｖＢ序列设计引物，多重ＰＣＲ检测沙门氏菌株基因组ＤＮＡ，以此实现对沙门氏菌的快速检验。

多重ＰＣＲ快速检验法可对沙门氏菌的多种毒力因子进行鉴定，是沙门氏菌株检验和鉴定的新方法。

变性高效液相色谱检测法　变性高效液相色谱结合多重ＰＣＲ反应技术可对食品中的沙门氏菌进行快速检测。

该方法以ｆｉｍＹ基因为靶基因，选择引物可实现对多重ＰＣＲ体系的优化，由此可对沙门氏菌进行快速鉴别。

该方法的特异性、灵敏性较高，其扩增产物为２８４ｂｐ，可对沙门氏菌进行快速检验，并能进一步验证多重ＰＣＲ的特异性。

沙门氏菌是食物常见的病原菌，具有传播媒介多、途径繁复等特点，容易污染食品而危害人体健康。

另外，沙门氏菌是多种有紧密联系细菌的泛指，包括导致伤寒、胃肠及引起食物中毒的众多细菌。

文中提到的几种快速检验法与传统检验法相比，具有操作简单、特异性强、灵敏度高等特点。

但这些方法也存在各自缺陷，试纸快速检验法检验纯菌时，若目菌＞１０３ｃｆｕ／ｍｌ时，纸片菌斑密集，可导致假阴性反应的发生。

ＰＣＲ检验的特异型取决于所选扩增的靶序列，若为保守的特异片段，所选引物就会显示出特异型。

ＬＡＭＰ技术的产物复杂多样，引物设计要求较高，目标单链ＤＮＡ的分离困难，无法对扩增产物的序列进行分析；其在同一温度条件下采用多条引物扩增非特异性条带，可能会出现假阳性结果。