聚丙烯酰胺凝胶电泳操
作步骤
集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
一、制胶前的准备
1、玻璃板的准备
用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将
1mm塑料薄片沾少许清水，使其贴在玻璃板上，然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。
2、垂直平板支架的安装
将准备好的玻璃板，放入垂直支架内，两侧用钢夹使其固定，钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜，两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。
3、玻璃板的密封
将1%琼脂糖用微波炉加热融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量琼脂溶液，沿玻璃板两边的缝隙内加入，使其密封，待其冷却凝固后备用。
二、凝胶的制备
1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）
配方：丙烯酰胺（Acr）290g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）10g
步骤：称取样品，倒入烧杯中
用蒸馏水定容至1 L
将烧杯置于搅拌器上，使溶液充分溶解至透明
将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用
2、10ｘTBE溶液的配制（1L）
配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：7.44g
步骤：称取各成分至烧杯
用蒸馏水定容至1L
用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解
分瓶倒装待用
3、PAGE凝胶的制备（一块胶为例）
配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵（AP）200ul;TEMED溶液20ul
步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶
4、灌胶
把垂直支架倾斜30°，将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，倒入过程中要避免气泡的产生，发现有气泡产生时，要待气泡消失后再倒入。灌胶完成后，用枪吸取少量水密封胶口，压平胶面。当胶面与水之间有一条明显的界限时，表示凝胶已凝固，可以开始点样电泳。
三、点样及电泳
1、0.5ｘTBE缓冲溶液的配制
量取950ml的蒸馏水，然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处，装瓶摇匀，备用。
2、垂直平板电泳槽的安装
将制作好的胶放入垂直电泳槽内，凹形玻璃向内侧。选择合适的梳子，轻轻插入玻璃板内，梳子底部与胶面刚好接触为宜。将插好梳子的玻璃板紧贴电泳槽的硅胶密封圈，用钢夹使其固定。
倒入0.5ｘTBE缓冲溶液于电泳槽内，以刚好淹没凹形玻璃平口为宜。
3、点样
用微量移液器吸取1ul的溴酚蓝溶液，根据PCR产物量大小吸取适量样品，点入胶孔内即可。每次加样前，微量移液器要用蒸馏水清洗，以避免交叉污染。为了确保各个胶孔之间都相互隔离，在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端，看是否有渗漏现象，如果有渗漏现象，要重新安装梳子。每块胶都要点上maker标记。
4、电泳
点样结束后，接通电源，调节电压至300V，90min，时间电泳时间根据PCR 产物分子量适当延长。
四、染色、显影
1、染色液、显色液的配制
染色液：0.1%AgNO
3。AgNO
3
1g 加水至1L 溶解待用。
显色液：2%NaOH。NaOH 20g 加水至1L溶解待用
2、取胶
把电泳完成后的玻璃板取下，小心拔出梳子
揭去凹形玻璃，去掉底部的琼脂凝胶，小心将胶揭下，放入染色槽中
3、染色
将胶用蒸馏水冲洗2次，倒入适量的染色液，以淹没胶体为宜，计时10min 4、显影
染色好的胶体，用蒸馏水冲洗2次，倒入显色液（用前加3ml的甲醛），轻摇至显出清晰的带为止
5、拍照
将显好色的胶用水冲洗2次后，置于玻璃板上，在室温下拍照，用于分析处理。
