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一例副猪嗜血杆菌的分离培养及药敏试验作者：申识川宋果王冠杰来源：《湖北畜牧兽医》2017年第10期摘要：副猪嗜血杆菌（HPS）主要危害保育猪群，引发以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，猪群一旦发病，病死率较高，给养猪业造成重大经济损失。
从疑似发生副猪嗜血杆菌病的河南濮阳某猪场无菌采集病料，并进行触片镜检、分离培养、生化试验。
结果成功分离到了副猪嗜血杆菌，药敏试验显示，分离菌株对氟苯尼考、泰妙菌素、氟甲砜霉素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟高敏，对红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素低敏。
根据药敏试验结果，对发病猪群进行治疗，取得了良好的治疗效果。
关键词：猪；副猪嗜血杆菌；分离培养；药敏试验中图分类号：S858.28 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）010-0013-02副猪嗜血杆菌（HPS）是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。
副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后保育舍阶段发病，感染高峰通常见于保育期的4～6周，发病率一般在10%～15%，严重时病死率可达 50%[1]。
该菌在特定的条件下，可以侵入猪机体，引发一种以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，又称为猪革拉斯氏病（Glasser′s disease）[2]，主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等[3]。
目前，根据免疫扩散试验，确定该菌有15个血清型，全国各地流行的血清型不完全相同。
由于副猪嗜血杆菌血清型多、产生耐药性快，致使临床疫苗免疫和用药效果不理想，给该病的预防和治疗带来很大的困难[4]。
相对于传统用药，分离鉴定该菌并进行药敏试验分析是比较有效的治疗方法。
2016年4月11日，濮阳地区某中小规模猪场出现25头47日龄的猪发病，根据患病猪流行病学调查情况、临床症状和剖检变化，疑似副猪嗜血杆菌病。
副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验薛国聪;任涛;徐成刚;涂玉蓉;蔡绍鑫;阳艳林;蔡丽丽;郑俏伟;张建民;廖明【摘要】对广东15个送检的疑似猪传染性副猪嗜血杆菌病的病猪样品,用TSA培养基进行细菌的分离,并对分离菌株进行细菌的形态观察、培养特性和生化试验鉴定,以及用副猪嗜血杆菌16s rRNA基因的特异性引物进行PCR鉴定.试验结果表明,有7株分离菌株扩增出了821 bp的特异性目的条带,结合形态观察、培养特性和生化试验鉴定,结果表明成功分离到了7株副猪嗜血杆菌;药敏试验结果显示,分离菌株对氨苄西林、多粘菌素、庆大霉素等药物较敏感.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(000)001【总页数】4页(P134-137)【关键词】副猪嗜血杆菌;分离鉴定;药敏试验【作者】薛国聪;任涛;徐成刚;涂玉蓉;蔡绍鑫;阳艳林;蔡丽丽;郑俏伟;张建民;廖明【作者单位】华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S854.4副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是猪革拉泽氏病(Glasser's disease)的病原菌,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属。
副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验张立宪;游一【摘要】Five strains of gram negative bacilli were isolated from a pig farm of Jiaozuo, which were suspected to be Haemophilus parasuis.Inorder to control the epidemic,Haemophilus parasuis was finally diagnosed by cultural and infection characteristics,biochemical tests,PCR and pathogenicity examination. The results of drug sensitivity test indicatedthat the isolated strains were sensitive to ceftiofur,cefotaxime, amikacin,lomefloxacin, and not sensitive tochloramphenicol,amoxicillin,clindamycin,chlortetracycline, enrofloxacin,doxycyclile, and resistant to penicillinG,ampicillin,streptomycin,sulfamonomethoxine.%从焦作市疑似感染副猪嗜血杆菌病的某猪场送检病料中分离到5株致病杆菌后，为控制疫情，对细菌进行培养特性、生化特性及PCR鉴定，并进行致病性和药敏试验。
结果显示，分离菌株为副猪嗜血杆菌，该菌对丁胺卡那、洛美沙星、头孢噻肟、头孢噻呋较为敏感，对强力霉素、恩诺沙星、金霉素、克林霉素、阿莫西林、氯霉素不太敏感，对链霉素、氨苄西林、青霉素G、磺胺间甲氧嘧啶耐药。
副猪嗜血杆菌病病原菌的分离与鉴定概述：副嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为革拉泽氏病(Glasser’SDisease)，影响从2周龄到4月龄的青年，主要在断奶前后和保育阶段发病。
通常见于5～8周龄的，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达到50％。
主要临床症状表现为咳嗽，呼吸困难，消瘦，跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为胸膜炎，心包炎，腹膜炎，关节炎和脑膜炎等。
随着世界养业的发展，该病已成为全球范围内影响养业的典型细菌性疾病。
由于饲养技术的调整以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。
近年来，随着水平的提高，副嗜血杆菌在我国各场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其损失相当惨重。
为预防该病，国内外虽然研制了各种类型的基因工程菌苗与多价灭活菌苗，但由于副嗜血杆菌血清型众多，各个地方的流行菌株各不相同，各个血清型之间的交叉保护性不高，菌苗的免疫效果并不理想。
笔者对长治市某大型场的副嗜血杆菌进行了分离和鉴定，以便选择针对性较强的菌株作为菌苗株，以起到更好的预防效果，并为副嗜血杆菌病的进一步研究奠定基础。
1材料与方法1．1病料的采集对2个病死仔进行尸体解剖(应无菌操作)，打开胸腔和腹腔，首先吸取积液或以棉签拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取内脏，内脏器官须实验室无菌操作，以灼烧过的手术刀烫烙剖面，取深层组织涂板培养。
1．2主要培养基本试验选择以下配方：胰蛋白胨0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性淀粉0．25g、枸椽酸钠0．15g、普通营养琼脂粉4．5g。
加蒸馏水至lOOmL，溶解后调pH至7．2～7．4，然后高压上述混合物，120％，15min。
在水浴中冷却至80％。
加10mL无菌脱纤绵羊血，在80％水浴中漩摇10～15min。
在冷却至50％时，加入无菌辅酶I(NAD)至15g／mL，加入万古霉素至50g／mL。
倾倒大约4mm厚平皿，冷却后4℃保存备用。
副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定和药敏试验在规模化集约化猪场内，副猪嗜血杆菌病时有发生，表现为多发性浆膜炎和关节炎，主要感染断奶前后和保育阶段猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。
我们实验室对湖南地区某猪场疑似病例进行了病原的分离鉴定和药敏试验，得到良好的治疗效果。
现将结果报告如下：一、材料1、病料：在无菌操作条件下取疑似病猪的肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液等。
2、培养基：巧克力琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）。
3、生化试验试剂：氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、糖、脲酶和伯胶糖等，均购自长沙金标生物有限公司。
4、药敏试纸：氟苯尼考、泰妙菌素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、氟甲砜霉素、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素, 均购自长沙金标生物有限公司。
二、方法及结果1、病理变化观察剖检病死猪，发现胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物。
肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺肿大暗紫红色，表面覆有纤维素性渗出物。
支气管内有淡红色泡沫样渗出物。
心包积液。
腹腔内有大量透明黄褐色渗出液，有的呈胶胨状凝块。
全身淋巴结肿大，暗红色。
2、触片镜检取发病猪的肺组织、心血、胸水和腹膜面涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性的细小杆菌，个别两极球杆状革兰氏阴性菌。
3、细菌分离培养无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种TSA平板，置37℃，5%CO2培养箱培养48h，出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小菌落，镜检可见大小不一、形态有细长、丝状的革兰氏阴性杆菌。
接种无NAD的TSA不生长。
而后挑取单个菌落，再进行纯培养。
4、生化试验挑取纯化菌落接种于氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等生化鉴定管中，同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5微升，置于37℃5%的CO2 培养箱培养48h，观察结果如下：。
福建畜牧兽医第35卷第2期2013年步跟踪检测研究。
参考文献：[1]何爱华,林奕坚,郭永健,等.大黄鱼幼鱼虹彩病毒感染的电镜研究[J].福建水产,1999(3):56-59.[2]Chen X H,Lin K B,Wang X W.Outbreaks of an iridovirus disease in maricultured large yellow croaker,Larimichthyscrocea (Richardson)in China [J].Journal of Fish Diseases,2003,26:615-619.[3]陈新华,董燕红.大黄鱼虹彩病毒PCR 快速检测试剂盒的研制[J].生物技术,2005(3):38-40.[4]OIE.Red Sea Bream Iridoviral Disease Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals [M].Paris:OfficeInternational des Epizooties,2009:251-261.[5]赵玉然,岳志芹,谭乐义,等.山东沿海部份地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析[J].渔业科学进展,2011,32(6):31-36.[6]萧枫,张奇亚.水生动物虹彩病毒的分子生物学[J].水生生物学报,2004,28(2):202-206.[7]李华,孙志鹏,李强,等.条石鲷检出的虹彩病毒特性研究[J].病毒学报,2011,27(2):158-164.[8]洪健,周雪平.ICTV 第八次报告的最新病毒分类系统[J].中国病毒学,2006,21(1):84-96.副猪嗜血杆菌（Hps ）常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪革拉泽氏病［1］。
随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。
副猪嗜血杆菌在实验室分离培养困难，生长条件苛刻，需要高营养成分和特殊的生长因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ，又称辅酶Ⅰ）［2］。
副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药物筛选防治试验邱永红;宋娟;杨莉;史开志;吴位珩;徐景峨;杨茂生【摘要】在贵州天柱、花溪、南明、毕节、龙里、福泉等县市一些养殖场和养猪户进行副猪嗜血杆菌病流行病学调查,对疑似副猪嗜血杆菌感染的病猪进行病理剖检,无菌条件下抽取心血、心包积液和胸腹水,并采集病变明显的肺、肝等病料进行分离培养鉴定.分离出的菌株按常规纸片法采用常用抗生素和中草药方剂进行药敏试验,结果表明该分离菌株对左旋氧氟沙星、磺胺二甲嘧啶、中草药方剂等高敏,抑菌圈直径＞15 mm；采用中草药方剂与磺胺二甲嘧啶对某猪场18头45日龄、体重相近、PCR检测阳性病例进行疗效对比试验,中草药方剂组和中草药方剂+磺胺二甲嘧啶组有增强机体抗病力功效；在12个猪场对疑似病例2 334头随机抽样开展PCR检测,对受到副猪嗜血杆菌病阳性感染的猪群使用筛选的药物进行综合防治试验,治愈率达到89.7％.【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】3页(P121-123)【关键词】副猪嗜血杆菌;病原检测;药敏试验;综合防治【作者】邱永红;宋娟;杨莉;史开志;吴位珩;徐景峨;杨茂生【作者单位】贵州省畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005【正文语种】中文【中图分类】S858.285.12008年10月和2012年4月，先后对贵州天柱、瓮安、丹寨、花溪、开阳、南明、小河、毕节、清镇、龙里、福泉等县市一些养殖场和养猪户进行副猪嗜血杆菌病流行病学调查。
试验主要调查12个地点，20日龄仔猪至6月龄肥育猪、种猪和后备猪共2 334头。
重点了解其疫苗接种史、临床症状、发病率、患病年龄、药物使用情况等。
对疑似副猪嗜血杆菌感染的病猪进行病理剖检、病原分离及血清学检测试验[1]。
在此基础上，建立了针对贵州地方株的PCR方法，配置了由金银花、蒲公英、枇杷叶、木通，黄芪、甘草组成的中草药方剂，并开展了对副猪嗜血杆菌的基本药敏试验及毒理试验[2-3]。
猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验张㊀静ꎬ史开志∗ꎬ王㊀婧ꎬ张㊀雄(贵州省农业科学院畜牧兽医研究所ꎬ贵州贵阳５５０００５)摘要:为查明贵阳市花溪区麦坪镇某猪场仔猪发生呼吸道疾病的病因ꎬ对送检的２头病猪采集病料进行细菌分离培养㊁染色镜检㊁生化试验㊁ＰＣＲ扩增及测序㊁药敏试验ꎮ结果:从病料样本中分离得到１株细菌ꎬ根据形态学和生化试验初步鉴定为副猪嗜血杆菌ꎻ应用细菌１６ＳｒＲＮＡ序列分析技术从分子水平对分离细菌进行分型鉴定ꎬ运用ＤＮＡＳｔａｒ软件与不同血清型副猪嗜血杆菌基因序列进行比对ꎬ发现分离菌与不同血清型副猪嗜血杆菌菌株１６ＳｒＲＮＡ序列同源且相似性为９７.４％~１００％ꎬ其中与血清５型相似性最高ꎻ系统进化分析显示ꎬ分离菌株与血清５型副猪嗜血杆菌进化关系最近ꎻ分离菌株对利福平㊁头孢氨苄㊁阿米卡星㊁环丙沙星㊁万古霉素敏感ꎮ结论:综合分离细菌传统鉴定方法和分子生物学鉴定方法的实验结果ꎬ确定分离菌株属于血清５型副猪嗜血杆菌ꎮ关键词:副猪嗜血杆菌ꎻ分离鉴定ꎻ１６ＳｒＲＮＡꎻ血清型ꎻ药敏试验中图分类号:Ｓ８５２.６１:Ｑ７㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００７－１４７４(２０１９)０２－００１９－０５ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓａｎｄＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｅＴｅｓｔＩｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌＰｉｇｌｅｔｓＺｈａｎｇＪｉｎｇꎬＳｈｉＫａｉｚｈｉ∗ꎬＷａｎｇＪｉｎｇꎬＺｈａｎｇＸｉｏｎｇ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕｉｚｈｏｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＧｕｉｙａｎｇＧｕｉｚｈｏｕ５５０００５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｃａｕｓｅｓｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｐｉｇｌｅｔｓｏｆｐｉｇｆａｒｍꎬｉｎＭａｉｐｉｎｇꎬＨｕａｘｉｄｉｓｔｒｉｃｔｏｆＧｕｉｚｈｏｕｐｒｏｖｉｎｃｅ.Ｂａｃｔｅｒｉａｌｉｓｏ￣ｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅꎬｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎꎬｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔꎬＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬａｎｄｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｔｗｏｓｉｃｋｐｉｇｓ.Ｒｅｓｕｌｔ:ｏｎｅｓｔｒａｉｎｓｕｓｐｅｃｔｅｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓꎬｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｐｒｅ￣ｌｉｍｉｎａｒｉｌｙａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔｓ.Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｃｌａｓｓｉｆｙａｎｄｉｄｅｎｔｉ￣ｆｙｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌ.ＤＮＡＳｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｒｏ￣ｔｙｐｅｓｓｔｒａｉｎｓꎬａｎｄｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｉｔｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｒｏｔｙｐｅｓｗｉｔｈｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｗｅｒｅ９７.４％~１００％ꎬｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｓｉｍｉ￣ｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｓｅｒｏｔｙｐｅ５.Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎｗａｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈｗｉｔｈｓｅｒｕｍｔｙｐｅ５.ＤｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｔｈｉｓｆｉｅｌｄｗｅｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｒｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬｃｅｆｔｒｉａｘｉｎꎬａｍｉｋａｃｉｎꎬｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎａｎｄｖａｎ￣ｃｏｍｙｃｉｎ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ:ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｗａｓｓｅｒｕｍｔｙｐｅ５Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓꎻＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ１６ＳｒＲＮＡꎻＳｅｒｏｔｙｐｅꎻＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＴｅｓｔ㊀㊀副猪嗜血杆菌(ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓꎬＨｐｓ)是收稿日期:２０１９－０２－０５基金项目: 基于ＰＡＭｓ转录组的ＨＰ－ＰＲＲＳＶ＆ＨＰＳ协同感染致病机制 贵州省农科院青年基金项目(黔农科院青年基金[２０１８]９２号)ꎻ 生猪健康养殖配套技术服务企业行动计划 贵州省科研机构服务企业行动计划项目(黔科合服企[２０１５]４００３号)ꎻ 基于免疫应答能力的贵州省地方猪抗病性研究 贵州省科技计划项目(黔科合支撑[２０１６]２５１０号)作者简介:张静(１９９３ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究方向:畜禽重大疫病分子遗传机制ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｇｚｓｘｍｓ＿ｚｊ＠１６３.ｃｏｍ∗通讯作者:史开志(１９８２ )ꎬ男ꎬ副研究员ꎬ研究方向:生猪疫病防控及贵州地方猪产业化与品牌化发展技术ꎮＥ－ｍａｉｌ:１８１９４３８５３＠ｑｑ.ｃｏｍ１种革兰氏阴性㊁具有多种不同形态的条件性致病菌ꎬ会引起纤维素性多发性浆膜炎㊁关节炎㊁脑膜炎㊁心包炎为主要病理特征的疾病[１]ꎮ主要引起２周龄到４月龄的猪发病ꎬ严重时病死率可达５０％[２]ꎮ近年来ꎬ贵州省生猪产业快速发展ꎬ养殖规模日益扩大ꎬ与此同时猪场内各种免疫抑制性疾病情况日趋复杂ꎬ猪场单独感染或继发感染副猪嗜血杆较为普遍ꎬ造成的经济损失也越发严重ꎮ副猪嗜血杆菌有１５种血清型ꎬ各血清型之间的致病力存在极大的差异ꎬ其中血清１型㊁５型㊁１０型㊁１２型㊁１３型和１４型具有高致病性ꎬ通常在感染４天后发病或死亡ꎮ我国的猪群中广泛存在且流行的血清型主要是血清４型㊁５型㊁１２型和１３型为主[３]ꎮ鉴于副猪嗜血杆菌生长条件严苛ꎬ且传统方法无法完全区分副猪嗜血杆菌的血清型[４]ꎬＯｌｖｅｒａＡ等[５]从细菌１６ＳｒＲＮＡ的种属特性出发ꎬ设计了副猪嗜血杆菌１６ＳｒＲＮＡ基因特异性引物ꎬ扩增得到８２２ｂｐ特异片段ꎬ经过序列分析可针对性地鉴定副猪嗜血杆菌ꎬ且可通过酶切将不同血清型的副猪嗜血杆菌分为不同的基因型ꎮ综合传统培养特性和１６ＳｒＲＮＡ序列特性对副猪嗜血杆菌临床分离株进行鉴定和分型ꎬ能有效克服传统方法对副猪嗜血杆菌分型鉴定存在的困难ꎮ２０１８年９月初ꎬ贵阳市花溪区麦坪镇某猪场陆续发生疫病ꎬ病猪临床表现为发热㊁呼吸困难㊁跛行等症状ꎻ剖检病理变化主要为肺实质性病变ꎬ心包内充满积液ꎬ胸腹腔有纤维素性渗出ꎬ胸腔积水ꎬ关节肿大ꎬ关节腔内积液ꎮ为确诊和控制疫情ꎬ本实验对送检的病料进行细菌分离培养ꎬ并对分离菌株进行鉴定和药敏试验ꎬ现报道如下ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀病料来源:发病猪场送检的２头疑似感染副猪嗜血杆菌病猪ꎮ１.１.２㊀主要试剂:(１)营养琼脂㊁酵母粉㊁ＮａＣｌ㊁蛋白胨㊁牛肉浸膏㊁新生牛血清㊁ＮＡＤ㊁革兰氏染色试剂ꎬ购自北京索莱宝科技有限公司ꎮ(２)细菌生化鉴定管和药敏纸片ꎬ购自杭州滨和微生物试剂有限公司和杭州微生物试剂有限公司ꎮ(３)２ˑＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ(Ｄｙｅ)ꎬ购自北京康为世纪生物科技有限公司ꎮ(４)ＤＮＡｉｓｏｐｌｕｓ㊁ＤＬ－２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎬ购自ＴａＫａＲａ生物公司ꎮ１.１.３㊀培养基:(１)副猪嗜血杆菌固体培养基:营养琼脂３.３ｇꎬ酵母粉１ｇꎬ溶于超纯水９０ｍＬ中ꎬ调节ｐＨ值至７.３~７.４ꎬ１２１ħ灭菌２５ｍｉｎꎬ冷却至５０ħ左右ꎬ加入ＮＡＤ１ｍＬ和新牛血清１０ｍＬꎬ倒入平皿ꎬ凝固后倒置于３７ħ培养箱中过夜无杂菌生长ꎬ４ħ保存备用ꎮ(２)副猪嗜血杆菌液体培养基:ＮａＣｌ１ｇꎬ蛋白胨１ｇꎬ酵母粉０.５ｇꎬ牛肉浸膏１ｇꎬ加入蒸馏水９０ｍＬꎬ调节ｐＨ值至７.３~７.４ꎬ１２１ħ灭菌２５ｍｉｎꎬ冷却至室温ꎬ加入ＮＡＤ１ｍＬ和新牛血清１０ｍＬꎬ４ħ保存备用ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀细菌分离培养及涂片镜检:无菌条件下ꎬ取发病猪的肺脏分别接种于液体培养基和固体培养基上ꎬ置于体积分数５％ＣＯ２培养箱ꎬ３７ħ培养２４~４８ｈꎬ观察菌落生长状况和形态ꎬ挑取菌落进行纯培养ꎬ革兰氏染色ꎬ显微镜下观察细菌形态ꎮ１.２.２㊀生化试验:将分离细菌纯培养物分别接种于添加１μｇ/ｍＬＮＡＤ的葡萄糖㊁蔗糖㊁半乳糖㊁麦芽糖㊁甘露醇等微量生化鉴定管ꎬ置体积分数５％ＣＯ２培养箱ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ观察生化反应结果ꎮ１.２.３㊀ＰＣＲ扩增及测序:提取菌液ＤＮＡ为模板ꎬ应用ＯｌｖｅｒａＡ等[５]设计的１６ＳｒＲＮＡ序列引物(Ｆ:５ －ＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴ－３ ꎬＲ:５ －ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴ－３ )对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ预扩增片段大小为８２２ｂｐꎮ(１)ＰＣＲ扩增体系２５μＬ:２ˑＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ(Ｄｙｅ)１２.５μＬꎬ１μｍｏｌ/Ｌ上游引物１μＬꎬ１μｍｏｌ/Ｌ下游引物１μＬꎬ模板ＤＮＡ２μＬꎬ无菌水补齐至２５μＬꎮ(２)ＰＣＲ反应程序:９４ħ预变性２ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５９ħ退火３０ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ共３５个循环ꎻ７２ħ延伸２ｍｉｎꎬ４ħ冷却２ｍｉｎꎮ取ＰＣＲ产物６μＬ于１.５％琼脂糖凝胶电泳观察ꎮＰＣＲ产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序ꎮ１.２.４㊀１６ＳｒＲＮＡ基因同源性比较与系统进化分析:运用ＤＮＡＳｔａｒ软件ꎬ将分离菌株与ＮＣＢＩ上１５种血清型副猪嗜血杆菌参考株１６ＳｒＲＮＡ基因的核酸序列进行同源性分析ꎬ并构建系统进化树ꎮ１.２.５㊀药敏试验:无菌条件下ꎬ取处于对数增长期的菌液１００μＬ于固体培养基上ꎬ用无菌涂布器将菌液均匀涂满整个平皿ꎬ然后用灭菌镊子夹取１３种药敏纸片放在适当的位置ꎬ轻轻按压固定ꎮ晾干后倒置于体积分数５％ＣＯ２培养箱ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ观察结果ꎬ测定抑菌环的大小ꎬ判断药物敏感性ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀分离细菌形态学特征㊀分离菌在固体培养基上生长ꎬ肉眼可观察到针尖大小㊁无色透明的菌落(见图１)ꎮ挑取单个菌落涂片进行革兰氏染色ꎬ镜检为革兰氏阴性菌ꎬ呈短杆状㊁长线状等多种形态(见图２)ꎮ２.２㊀生化试验结果㊀对纯化细菌进行生化试验ꎬ结果显示该菌株各项生化鉴定结果符合副猪嗜血杆菌标准菌株的特征[６]ꎮ见表１ꎮ图１㊀分离菌菌落形态图２㊀分离菌革兰氏染色镜检(１０ˑ１００)表１㊀分离菌株生化鉴定结果㊀项目葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖木糖甘露醇阿拉伯糖半乳糖七叶苷尿素酶㊀硝酸盐(还原)结果＋－＋＋－－＋＋－＋－㊀㊀注:＋为阳性ꎬ－为阴性２.３㊀ＰＣＲ扩增及测序结果㊀为进一步确定该菌ꎬ以该分离菌株ＤＮＡ为模板ꎬ利用副猪嗜血杆菌１６ＳｒＲＮＡ引物成功扩增出长度约为８２２ｂｐ的基因片段ꎬ得到与预期目的片段大小相一致的扩增产物(见图３)ꎬ确定为副猪嗜血杆菌(命名为:ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１)ꎮＰＣＲ产物测序结果见图４ꎮ２.４㊀１６ＳｒＲＮＡ基因同源性比较与系统进化分析结果２.４.１㊀１６ＳｒＲＮＡ基因同源性比较分析:将ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１的１６ＳｒＲＮＡ基因核苷酸序列与其他参考菌株进行同源性比对ꎬ结果见图５ꎮＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１与参考菌株的１６ＳｒＲＮＡ核苷酸序列同源ꎬ且相似性为９７.４％~１００％ꎻ与血清５型参考菌株的核苷酸序列相似性高达１００％ꎮ图３㊀分离菌１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ扩增结果Ｍ:ＤＬ－２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:阴性对照ꎻ２:分离菌株图４㊀分离菌(ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１)１６ＳｒＲＮＡ序列图５㊀ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１与参考菌株同源性比对结果２.４.２㊀１６ＳｒＲＮＡ基因系统进化分析:应用ＤＮＡＳｔａｒ软件ＣｌｕｓｔａＷ算法对ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１分离株１６ＳｒＲＮＡ基因核苷酸序列及参考菌株绘制系统发育进化树ꎬ结果ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１与血清５型Ｈｐｓ参考株属于同一分支ꎮ见图６ꎮ图６㊀基于Ｈｐｓ１６ＳｒＲＮＡ基因核苷酸序列的系统进化树２.５㊀药敏试验结果㊀选择１３种药敏纸片对该菌进行药敏试验ꎬ结果分离菌株对利福平㊁头孢氨苄㊁阿米卡星㊁环丙沙星㊁万古霉素敏感ꎬ对阿莫西林㊁林可霉素㊁链霉素㊁多西环素㊁红霉素㊁青霉素㊁庆大霉素耐药(见表２)ꎮ该猪场可选择利福平㊁头孢氨苄等５种敏感药物对病猪进行治疗ꎮ表２㊀副猪嗜血杆菌分离株药敏试验结果㊀药物名称抑菌环直径(ｍｍ)判定结果氟苯尼考１７Ｉ阿莫西林１３Ｒ利福平３４Ｓ林可霉素１１Ｒ链霉素０Ｒ头孢氨苄３２Ｓ多西环素１３Ｒ阿米卡星２２Ｓ红霉素０Ｒ青霉素０Ｒ环丙沙星２８Ｓ万古霉素２２Ｓ庆大霉素１２Ｒ㊀㊀注:药物敏感性按«抗菌药物药敏试验判断标准»进行判断ꎬ抑菌环直径ȡ２０ｍｍ为敏感(Ｓ)ꎬ抑菌环直径在１５~２０ｍｍ之间为不敏感(Ｉ)ꎬ抑菌环直径ɤ１５ｍｍ为耐药(Ｒ)３㊀结论与讨论３.１㊀根据对猪场送检病料进行细菌分离培养㊁染色镜检㊁生化试验㊁ＰＣＲ扩增及测序ꎬ综合鉴定分离菌为副猪嗜血杆菌(命名为:ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１)ꎬ确诊该猪场发病原因为副猪嗜血杆菌感染所致ꎮ分离菌株与１~１５型参考菌株的核苷酸序列同源性为９７ ４％~１００％ꎬ其中与血清５型副猪嗜血杆菌序列同源性高达１００％ꎻ系统进化树分析显示ꎬ该菌株与血清５型副猪嗜血杆菌聚到１个分支上ꎬ说明该菌株与血清５型副猪嗜血杆菌的亲缘关系最近ꎬ表明从该场分离得到的菌株为血清５型副猪嗜血杆菌ꎮ这符合中国流行的副猪嗜血杆菌血清型为４型和５型的情况[７~９]ꎬ也说明副猪嗜血杆菌的血清型与基因型存在一致性ꎮ３.２㊀副猪嗜血杆菌５型属于目前国内流行的血清型之一ꎮ临床上感染该血清型的猪在４天内发病或者死亡ꎮ相关感染试验表明ꎬ气管或腹腔感染副猪嗜血杆菌的猪常因急性败血症在接种１~２ｄ后出现死亡[１０~１３]ꎮ该猪场出现的疫情与感染血清５型副猪嗜血杆菌发病急㊁影响大的特点相一致ꎮ３.３㊀药敏试验结果显示ꎬ分离菌株对利福平㊁头孢氨苄㊁阿米卡星㊁环丙沙星㊁万古霉素高度敏感ꎬ发病猪场用上述敏感药物进行治疗和预防都有很好的效果ꎮ副猪嗜血杆菌不同的血清型之间的药物敏感性存在差异ꎬ即使是同一血清型ꎬ来自不同地区的不同菌株对同一种药物的敏感性也有很大差异ꎬ故临床用药要根据分离菌株药敏试验结果采取针对性的防治措施ꎮ从预防的角度来讲ꎬ疫苗免疫是预防副猪嗜血杆菌的有效方法之一ꎬ该场可利用分离的副猪嗜血杆菌制备自家疫苗对猪进行免疫接种ꎮ参考文献:[１]㊀ＨｉｌｌＣＥꎬＭｅｔｃａｌｆＤＳꎬＭａｃＩｎｎｅｓＪＩ.ＡｓｅａｒｃｈｆｏｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙＲＴ－ＰＣＲ[Ｊ].Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ９６(２):１８９－２０２.[２]㊀张爱朝.规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物试验[Ｊ].兽医导刊ꎬ２０１７(１２):１９５.[３]㊀李富祥ꎬ李华春ꎬ宋建领ꎬ等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及１６ＳｒＲＮＡ序列分析[Ｊ].中国畜牧兽医ꎬ２０１２ꎬ３９(８):６８－７２.[４]㊀ＫｉｅｌｓｔｅｉｎＰꎬＲａｐｐｇａｂｒｉｅｌｓｏｎＶＪ.Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎｏｆ１５ｓｅｒｏ￣ｖａｒｓｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕ￣ｓｉｏｎｕｓｉｎｇｈｅａｔ－ｓｔａｂｌｅａｎｔｉｇｅｎｅｘｔｒａｃｔｓ[Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９２ꎬ３０(４):８６２－８６５. [５]㊀ＯｌｖｅｒａＡꎬＣａｌｓａｍｉｇｌｉａＭꎬＡｒａｇｏｎＶ.ＧｅｎｏｔｙｐｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓ[Ｊ].Ａｐｐｌｅｎｖｉｒｏｎｍｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌꎬ２００６ꎬ７２(６):３９８４－３９９２.[６]㊀陆承平.兽医微生物学[Ｍ].北京:中国农业大学出版社ꎬ２００１:２５８－２６１.[７]㊀蔡旭旺.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[Ｄ].武汉:华中农业大学ꎬ２００６. [８]㊀常洪涛ꎬ刘慧敏ꎬ陈陆ꎬ等.不同猪源副猪嗜血杆菌河南分离株１６ＳｒＲＮＡ基因的遗传进化分析[Ｊ].中国兽医杂志ꎬ２０１５ꎬ５１(９):７－９.[９]㊀徐引弟ꎬ鲁杨超ꎬ王治方ꎬ等.４型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性研究[Ｊ].黑龙江畜牧兽医ꎬ２０１８(１３):１３１－１３４ꎬ２４６.[１０]㊀王大鹏ꎬ吴家强ꎬ于江ꎬ等.副猪嗜血杆菌血清５型分离株生长曲线与致病力研究[Ｊ].西南农业学报ꎬ２０１１ꎬ２４(５):１９７２－１９７６.[１１]㊀赵国振ꎬ李晓华ꎬ戴爱玲ꎬ等.血清５型副猪嗜血杆菌的仔猪致病性研究[Ｊ].龙岩学院学报ꎬ２０１５ꎬ３３(５):７９－８４.[１２]㊀Ａ.Ｊ.ＭａｒｔíｎｄｅｌａＦｕｅｎｔｅꎬＣ.Ｂ.ＧｕｔｉéｒｒｅｚＭａｒｔíｎꎬＣ.ＰéｒｅｚＭａｒｔíｎｅｚꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｇｌäｓｓｅｒ ｓｄｉｓｅａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｐｉｇｓｂｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１４０(２－３):１６９－１７６. [１３]㊀ＢｌａｎｃｏＩꎬＧａｌｉｎａｐａｎｔｏｊａＬꎬＯｌｉｖｅｉｒａＳꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｃｏｌｏｓｔｒｕｍｓ－ｄｅｐｒｉｖｅｄａｎｄｓｏｗ－ｒｅａｒｅｄｐｉｇｌｅｔｓ[Ｊ].Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ１０３(１):２１－２７.。
收稿日期:20070615作者简介:徐引弟(1974),女,湖北浠水人,助理研究员,博士,主要从事动物病原微生物研究。
猪高热病副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验徐引弟,郭成留,王治方,张玉杨(河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州450002)摘要:从2006～2007年河南省发生猪高热病的65家猪场196份病料中分离到6株革兰氏阴性细小杆菌,通过培养特性试验和生化试验初步怀疑为副猪嗜血杆菌,将其进行PCR 鉴定,结果表明,分离菌为副猪嗜血杆菌。
对6株分离株进行小鼠毒力试验和药物敏感试验,结果表明,6株分离菌能致死小鼠,对头孢他啶、头孢噻呋、头孢唑啉、头孢哌酮、多西环素、痢特灵敏感。
关键词:猪高热病;副猪嗜血杆菌;分离;鉴定;药敏试验中图分类号:S828 文献标识码:A 文章编号:10043268(2007)10009904Isolation ,Identification and Drug Sensitive Test ofH aemop hil us parasuis in Swine High Fever DiseaseXU Y in 2di ,GUO Cheng 2liu ,WAN G Zhi 2fang ,ZHAN G Yu 2yang(Institute of Animal Huabandry and Veterinary Science ,Henan Acadmy ofAgricultural Sciences ,Zhengzhou 450002,China )Abstract :Six Gram negative small bacilli were isolated from 196samples of 65farms ,which had high fever disease f rom 2006to 2007.These six st rains were suspected to be H aeop il us p aras uis (Hp s )according to t heir cult ure characteristics and biochemical assay.These st rains were identi 2fied by PCR.The result showed t hat all t he 6st rains were Hp s.The mice virulence and drug senstive test showed t hat t hese 6strains were let hal to mice and sensetive to ceftazidime ,cefo 2taxime ,cefazolin ,cefoperazone ,doxycycline and f urazolidone.K ey w ords :Swine high fever disease ;H aeopil us p aras uis (Hp s );Isolation ;Identification ;Drug sensitive test 猪高热病综合征是近年来由多种病原混合感染和继发感染引起的猪的一种以发热、皮肤发红、出现呼吸道症状和繁殖障碍等症状为主要特征的综合征。
2006年6月份以来,该病在我国南方部分省份和中部几个省的部分地区大面积流行,呈现发病急、发病率高、死亡率高、治疗效果差的特点,给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。
研究结果表明,猪高热病是由高致病性猪繁殖障碍与呼吸综合症病毒(PRRSV )为其主要病原,辅以其他病原混合或继发感染而引起。
其中副猪嗜血杆菌(Hp s )是重要的继发或混合感染的病原之一,加重了高热病的症状,增加死亡率[1]。
副猪嗜血杆菌于1910年由Gl sser 首次报道[2],是常规饲养猪群上呼吸道的一种常在菌,但在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,该病又称为革拉瑟氏病(Gl sser’s dis 2ease ),可以影响2～4月龄的猪,通常见于4～8周龄,发病率和死亡率均很高[3]。
本试验对猪高热病副猪嗜血杆菌的感染进行了初步研究,分离鉴定了6株副猪嗜血杆菌,并进行了药敏试验,以便为指导猪场合理用药,控制和治疗高热病继发感染该病提供依据。
・99・1 材料和方法1.1 病料来源2006年8月至2007年5月,从河南省不同地区发生高热病的65个猪场共采集病猪肺脏110份、心血56份、关节液27份以及脑3份,共196份病料。
1.2 主要试剂及培养基NAD,购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
犊牛血清自制,过滤除菌,使用前经56℃灭活30min。
胰蛋白大豆琼脂TSA(t ryptic soy agar),胰蛋白大豆肉活TSB(t ryptic soy brot h)购自Difco 公司。
鲜血培养基购自郑州康利生物公司。
微量生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。
药敏纸片购自北京天坛生物科技公司。
Taq DNA聚合酶、dN TPs、DL2000DNA Marker均购自大连宝生物有限公司。
1.3 主要仪器与设备凝胶成像系统、电泳仪均为Bio-Rad公司产品;PCR扩增仪为Touchgene公司产品;台式高速冷冻离心机、纯水仪均为力康公司产品;SHZ-82气浴恒温振荡器为江苏金坛中大仪器厂产品;超净工作台为江苏净化公司产品;CO2培养箱、超低温冰箱均为REVCO产品;E200-F三目生物显微镜为Nikon公司产品。
1.4 供试动物6～8周龄SPF级BALB/c小鼠,购自郑州大学实验动物中心。
1.5 培养基配制TSB培养基的制备:称TSB培养基30g溶于1000mL水中,于115℃高压灭菌20min。
使用前加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.01%NAD即成。
TSA培养基的制备:称TSA培养基40g溶于1000mL水中,于115℃高压灭菌20min。
待温度降至45℃左右,加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.01%NAD,充分摇匀后倒平皿,4℃保存备用。
麦康凯琼脂培养基:称取麦康凯琼脂51g,加入蒸馏水至1000mL,混匀,121℃灭菌15min。
冷至50℃左右,倾注灭菌平皿,凝固后4℃保存备用。
1.6 分离培养与鉴定1.6.1 分离纯化 将病猪肺脏、心血、关节液接种于TSA固体培养基,置于5%的CO2培养箱,37℃培养24～48h;挑取圆形、光滑湿润、无色透明、直径1～2mm的可疑菌落。
取上述菌落抹片革兰氏染色后在显微镜下观察,细菌为革兰氏阴性细小杆菌,具有多种不同的形态,从单个的球杆菌到长的、细长的、丝状的菌体。
1.6.2 培养特性 将可疑菌落分别接种不加NAD 的TSA、麦康凯琼脂培养基、普通血平板、含V因子的TSA,观察菌落生长情况和形态大小。
1.6.3 生化试验 将可疑菌落接种生化鉴定管,生化鉴定管中同时加入5μL0.01%的NAD,置于37℃5%的CO2培养箱,培养48h,观察结果。
1.6.4 PCR鉴定 将被检菌株菌液10000r/min 离心5min,弃上清液,用无菌水悬浮,涡旋后,于沸水中水浴10min后,再放置冰上;10000r/min离心5min,取上清液作模板。
同时,以猪水肿大肠杆菌强毒株ED3和猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1为阴性对照。
参照华中农业大学蔡旭旺博士论文[4]及文献[5],根据副猪嗜血杆菌16S rRNA(M75065)序列设计引物,PCR扩增的产物为822bp大小的片段,引物由上海生工公司合成上游引物:5′-GGC T TC GTC ACC C TC T GT-3′下游引物:5′-GT G A T G A GG AA G GGT GGT GT-3′反应体系(50μL):10×缓冲液5μL,2mmol/L dN TPs1μL,10μmol/L上游引物1μL,10μmol/L 下游引物1μL,TaqE1μL,模板3μL,灭菌超纯水39μL。
反应条件:94℃变性4min,进入循环:94℃1min,59℃1min,72℃1min,共35个循环,最后72℃延伸10min,PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。
1.6.5 小鼠毒力试验 将各分离菌株接种含NAD 的TSB,在37℃250r/min振摇培养24h。
用生理盐水稀释菌数约为1010个/mL,腹腔注射小白鼠0.2mL;同时设生理盐水阴性对照。
接种后观察发病及死亡情况,剖检小白鼠,无菌取其心血分离细菌。
1.6.6 药物敏感试验 将分离鉴定的阳性菌接种于含NAD的TSA培养基,涂匀、选取21种抗生素的药敏纸片贴于培养基上。
于37℃含5%的CO2培养箱,培养48h,测量抑菌环直径并判定。
1.6.7 副猪嗜血杆菌的冻存 用含NAD的TSB 培养基培养分离鉴定的菌株,离心收集菌体,加入灭・1・菌的脱脂牛奶,冻干后80℃保存。
2 结果与分析2.1 培养特性与镜检在加有血清和NAD 的TSA 培养基上24h 长成无色透明菌落,边缘整齐,圆形隆起,针尖大小,直径1～2mm (图1)。
在麦康凯培养基、普通琼脂培养基、不加NAD 的TSA 培养基上均不能生长。
表明分离的菌株具有NAD 依赖性。
在血平板上48h 长成针尖大小的半透明菌落,无溶血现象。
革兰氏染色均为阴性短小杆菌,菌体细小,形态多样,多散在,也有成双或短链状或长链或长丝状(图2)。
2.2 生化试验生化试验结果表明,分离的可疑菌脲酶试验阴性,氧化酶试验阴性,接触酶试验阳性,硝酸盐还原试验阳性,吲哚试验阴性;发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等碳水化合物,不发酵阿拉伯糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇、木糖。
符合副猪嗜血杆菌的生化特征。
2.3 PCR 鉴定对经培养及生化试验鉴定阳性的6株可疑菌进行PCR 扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳,证实大小均与预期大小一致,其他菌未扩增出条带,表明所分离的6株菌为副猪嗜血杆菌(图3)。
图3 H ps 16S r RNA PCR 扩增结果2.4 小鼠毒力试验接种小鼠24h 内死亡,取死亡鼠心血接种含NAD 的TSA 培养基。
结果分离出纯的经鉴定与以上一致的细菌,证明为副猪嗜血杆菌。
2.5 药敏试验药敏试验结果表明,分离的6株副猪嗜血杆菌对青霉素G 、氨苄西林、万古霉素、氯霉素、新霉素、阿莫西林、克林霉素、链霉素和复方新诺明均不敏感。
对庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、丁胺卡那、四环素、中度敏感。
对头孢他啶、头孢噻呋、头孢唑啉、头孢哌酮、多西环素、痢特灵敏感。
3 讨论试验从196份病料中仅分离到6株副猪嗜血杆菌,而与临床上发生多发性浆膜炎和关节炎等疑似Hp s 的比例不符,主要原因可能有以下几点。
