基因治疗(概述)知识分享42页PPT

基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略


直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长； 增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞； 改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法

基因干预技术 反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ② 作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞 的耐药性，提高化疗效果。 RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表 达的恶性肿瘤治疗。 反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂， 从而抑制原癌基因转录。
遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%， 必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展 基因治疗研究：（30余种） 在DNA水平上明确其发病原因及机制； 单基因遗传病，而且属隐形遗传； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞 中表达并发挥其生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。
基因转移的生物学与非生物学方法
生物学方法：以病毒载体作为转移系统
逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector) 腺病毒(adenovirus,AV)基因组可作为载体携带治疗基因
腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus, AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的 人类单基因遗传病
腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； 血友病：针对凝血因子Ⅸ基因； 中国科学家1991年12月成功进行了血友病B的基因 治疗。 将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者 自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度 上升，凝血活性改善。

发夹(Hairpin)状核酶的结构。 核酶和底物组成螺旋1、2及 对称的环1、5。4个螺旋包 括18个碱基对，只有一个非 正规碱基对A-G。发夹核酶 分别为2个结构域，结构域I 由螺旋1、2和环1、5组成， 结构域II由螺旋3、4和环2 、 3、4组成。腺苷酸残基 A15连接两个结构域，使它 们相互靠近相互作用，形成 催化反应所必需的三级结 构。环3被认为与催化作用 无关。
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另一类为重组1型单纯疱疹病毒。即 删除了与复制相关及非必需基因， 以减少细胞毒性，可用于宿主神经 元细胞中长期表达外源治疗基因。 但如果宿主神经元已经潜伏了野生 型单纯疱疹病毒，这就很可能重新 激活病毒而进入裂解期。
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基于此哈佛大学的姚丰博士利用病毒自身的 “反式显性失活”（trans-dominant negative）而构建了一个既可抑制自身病毒 复制，又可抑制野生型病毒复制的重组病毒。
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构建腺病毒载体系统，释放和表达端粒酶RNA反义寡
核苷酸(anti-hTR) siRNA。
（a）pAdeno-X的圆形图。此pAdeno-X载体的DNA来
源于5型腺病毒(Ad5) 基因组，通过删除了E1 和E3区
而构建。siRNA表达盒来自pSIREN克隆的PI-Sce I 和
I-Ceu I酶切片段，再将该片段插入到通过PI-SceI 和
（四）单纯性疱疹病毒载体
单纯性疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）基因组为152kb的双链DNA，有3个 复制起始点，3个包装信号位点。 特点： 1.缺失多个基因 仍能复制； 2.只要有包装信号，外源DNA就可 被包装入
病毒颗粒。
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质粒载体介导的细胞内表达siRNA法
通常通过带有RNA pol Ⅲ启动子的siRNA表达 质粒载体，将长度为21nt的针对特定基因的双 链siRNA或者长度为45～50nt的小分子发夹 RNA (small hairpinRNA ,shRNA)转染到细胞 中，shRNA在细胞内会自动被加工成siRNA， 从而引发“沉默”或表达抑制。
此病毒可以作为新型、安全性单纯疱疹病毒 载体，用于临床实验的研究。HSV载体不仅 感染神经元细胞，亦可感染非神经元细胞如 上皮细胞，目前HSV载体已用于恶性间皮瘤、 帕金森症等疾病的治疗研究中。
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HSV作为基因治疗载体有以下特点：
（1）基因组序列已十分清楚； （2）可容30kb外源DNA； （3）宿主范围广，可感染脊椎动物的各种细
（四）单纯性疱疹病毒载体
单纯性疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）基因组为152kb的双链DNA，有3个 复制起始点，3个包装信号位点。 特点： 1.缺失多个基因 仍能复制； 2.只要有包装信号，外源DNA就可 被包装入
病毒颗粒。
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1型单纯疱疹病毒（HSV-1）属于人嗜神经病毒，可
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虽然siRNA在哺乳动物细胞中的应用才开始不久， 但它正以飞快地速度发展成为基因治疗的一种新方 法。
如果siRNA通过尾静脉高压注射能有效到达肝脏， 那么他将有希望广泛应用于治疗各种肝病。
A.P.McCaffrey等（2003）通过表达shRNA的载体 在培养细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失 的Ceu I消解的pAdeno-X载体中。

• 基因干预（gene interference）：采用 特定的方式抑制某个基因的表达，或 者通过破坏某个基因而使之不能表达， 以达到治疗疾病的目的。
Hale Waihona Puke 基因置换或基因添加的必要条件
对导入的基因及其产物有详尽的了解 外来基因能有效地导入靶细胞 导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留 导入基因能有适度水平的表达 基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全 无害
• 产物功能：结构基因，调节基因。
基因治疗的概念
• 一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞， 以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗 方法。 • At the most basic level, gene therapy can be described as the intracellular delivery of genetic material to generate a theraputic effect by correcting an existing abnormality or providing cells with a new function.
• 重组型病毒载体:以完整的病毒基因组为改造对
象，选择性删除病毒的某些必需基因（早期基因、 控制表达的基因），缺失的功能由互补细胞反式提 供；利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入 病毒基因组的非必需区,不改变病毒复制和包装所 需的顺式元件。
• 无病毒基因的病毒载体：由载体质粒和辅助系
统组成。载体质粒：由外源基因表达盒、病毒复制 和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成；辅 助系统：由病毒复制和包装所必需的反式作用元件 组成
基因治疗方式
• 回体基因治疗（ex vivo） • 体内基因治疗（in vivo）

• 编码β2肾上腺素能受体的 质粒注入约克猪的右房的起 搏部位, 上调肾上腺素能受体 的表达。 电生理的检测显示, 心房组织 的局部过表达肾上腺素能受体 可以明显增强起搏组织的变时 效应，使现存的或病变的起搏 细胞的功能得到改善和加强。
心速 108→127→163 50%↑
生物性的起搏细胞
• 起搏离子流If是一种超极化激 活的内向离子流, 它介导窦房结的 四期自动除极。
• 干细胞是一种具有多分化潜能和自我复 制功能的早期未分化细胞，在特定的条件下 可能分化为不同的功能细胞，形成多种组织 和器官。
• 目前主要进行的是体外干细胞培养移植研 究，包括胚胎干细胞（embryonic stem cell ， ESC）、骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）等。
Qu J et al. Circulation 2003;107:1106-1109
Pacemaker function in in vitro model
• mHCN2转染的hMSCs 影响耦合的心脏细胞 的兴奋性。
• 综上，过表达HCN2 基因可以增大起搏电 流, 使移植的心肌细胞 具有起搏能力。
• 超极化激活的环核苷酸门控的 ( Hyperpolarization activated cyclicnucleotide gated, HCN ) 通 道是心脏起搏离子流If 产生的基 础。
• HCN基因家族的四个成员目 前发现在心脏中存在的有3 个： HCN1、HCN2 和HCN4。
ECG leads I, II, and RA, and LA (overlying injection site) electrograms during normal sinus rhythm in an anesthetized dog previously injected with HCN2+GFP