蛋白质电泳实验
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尿素-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1试剂的配制
①30%凝胶母液
丙烯酰胺和N, N'-亚甲双丙烯酰胺。以温热(利于溶解双丙烯酰胺)的去离子水配制含
有29.2 %( w/v)丙烯酰胺和0.8 %( w/v)N, N '-亚甲双丙烯酰胺的贮存液,丙烯酰胺
和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸,这一脱氨基反应是光催化或碱催化的,故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温,每隔几个
月须重新配制。
小心:丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
② 4 倍SDS分离胶缓冲液(4 X , pH 8.8) (200 ml)
称取SDS 0.8 g (4%) , Tris 36.342 g (1.5mol/L) ,溶解(必要时加热),用盐酸调pH 为8.8,定容至200 mL。
③4倍SDS浓缩胶(堆积胶或积层胶)缓冲液。
(4 X, pH 6.8) (100 ml )
称取SDS 0.4 g (4%) , Tris 6.051 g (0.5mol/L) ,溶解(必要时加热),用盐酸调pH为
6.8,定容至100 mL o
④TEMED(N,N,N ,N'-四甲基乙二胺)。
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
⑤10%过硫酸铵。
0.5 g过硫酸铵溶于5 mL去离子水中,可于4 C下存放数月
⑥Tris-甘氨酸电极缓冲液(1 L )
称取3g Tris (25 mmol/L ) ,14.4 g 甘氨酸(192 mmol/L),1 g SDS ( 0.1 %),溶解后定
容至1L, pH应该在8.3左右。也可以制成10X的储存液在室温下长期保存。
⑦样品处理液(5 X样品缓冲液)(10 mL)
称取Tris 0.07266 g Tris (60 mmol/L), SDS 0.02 g (2%, W/V), 溶于 4 mL 水中,用HCl小心调节pH为6.8,再加5 mL50%的甘油(终浓度25%, V/V) ,0.5 mL2-巯基乙醇(14.4
mmol/L),溴酚蓝0.01 g (终浓度0.1%),加去离子水至10 mL。可以在4C下存放数周,或在—20 C 下保存数月。
⑧考马斯亮蓝R250染色液(1000 mL)
0.1%考马斯亮蓝R250
考马斯亮蓝R-250 1.0 g ( 0.1%, W/V )
无水乙醇450 mL (45%, V/V)
冰醋酸100 mL (10%, V/V)
加水定容至1000 mL
⑨脱色液(1000 mL)
无水乙醇100mL (10%, V/V)
冰醋酸100mL (10%, V/V)
加水定容至1000 mL
2 •尿素—SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
⑴ 根据厂家说明书安装玻璃板。(琼脂封口)
⑵ 确定所需凝胶溶液体积,按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定
体积的分离胶溶液。(一旦加入TEMED马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。)
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳15 %分离胶溶液(20mL/电泳板,pH8.8){
水 2.4mL
尿素7.2g
分离胶缓冲液5mL
30%凝胶母液 4. mL
混匀后,加入10% AP 100卩L, TEMED 10卩L,迅速混合。
⑶ 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加
0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水(约2~3 mm高),以阻止氧气进入凝胶溶液
⑷分离胶聚合完全后(约30~60分钟),倾出覆盖水层,再用滤纸吸净残留水。
⑸制备浓缩胶:按下表给出的数据,在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺
溶液。(一旦加入TEMED马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。)配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶溶液(10 mL/电泳板,pH6.8)
一水 5.75 mL
-浓缩胶缓冲液 2.5 mL
-30%凝胶母液 1.75 mL
混匀后,加入10% AP 66卩L, TEMED 10卩L,迅速混合。
⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气
泡,再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙,将凝胶垂直放置于室温下。
⑺在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按4:1体积比加入样品处理液,在
100 C加热3~4分钟以使蛋白质变性。
⑻浓缩胶聚合完全后(30~60分钟),小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
⑼ 按预定顺序加样,加样量通常为10〜25卩L (1.5 mm厚的胶)。
⑽ 将电泳装置与电源相接,凝胶上所加恒电流为10 mA。当染料前沿进入分离胶后,把电流提高到15 mA,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5 cm,然后关闭电源。
(11)从电泳装置上卸下玻璃板,轻轻撬开玻璃板。紧靠最左边一孔(第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
3 •用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色
染色1〜2小时或过夜。
脱色液:脱色需3〜10小时,其间更换多次脱色液至背景清楚。
此方法检测灵敏度为0.2〜1.0 g。脱色后,可将凝胶浸于水中,长期封装在塑料袋内
而不降低染色强度。为永久性记录,可对凝胶进行拍照,或将凝胶干燥成胶片。