ad木聚糖酶(XYNB)的分离纯化与性质研究
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双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究
双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究刘雨露;王华广;杜建辉;唐蕾【摘要】木聚糖酶Xyn2083来源于Clostridium clariflavum,是一种双功能木聚糖酶,包括2个催化结构域GH11、GH10(glycosyl hydrolase families,GH)和一个非催化结构域Dockerin I.在文中,将该双功能木聚糖酶基因及GH11、GH10这2个结构域的木聚糖酶基因成功在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行异源表达,得到了3个重组木聚糖酶.将纯化后重组酶进行酶学性质分析,结果表明Xyn2083的最适反应温度与pH值分别为60℃、6.0,且在60℃以下或pH4.5 ～10.5的范围内有较好的稳定性.水解反应研究表明,Xyn2083中GH11和GH10结构域协同作用于木聚糖底物,将木聚糖水解为木糖和木二糖.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)010【总页数】8页(P30-37)【关键词】Clostridium clariflavum;木聚糖酶;异源表达;木聚糖【作者】刘雨露;王华广;杜建辉;唐蕾【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122【正文语种】中文木聚糖酶是一类可以水解木聚糖为木寡糖和木糖的酶系，β-1,4-D内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是木聚糖水解过程中的关键酶，它能够水解木聚糖骨架中的β-1，4-木糖苷键[1]。
根据氨基酸序列的相似性，木聚糖酶主要分为糖苷水解酶 (glycosyl hydrolase, GH) 10和11两大家族。
木聚糖酶在食品、纺织、造纸、饲料、生物能源等工业领域具有较大的应用前景[2]。
木聚糖酶XynB的纯化与酶学性质
１ ． ３ 方 法
１ ． １ 菌种
Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ通 过Ｄ Ｎ Ｓ 法 对 该
酶进 行酶 学性质表 征 ，当 反应条 件为 ５ ０。 ｃ ，ｐ Ｈ ６ ． ５ 时该酶 具有 最 本实验选取重组质粒ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ ａ — ｘ ｙ ｎ Ｂ ，在Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １ 进行 大活 力 。经 生物 学软 件预 测 该酶 等 电点 为４ ． ８ ２ ，其 氨基 酸序 列 与 表 达 。取 保存 的工 程 菌 ５ ０ ｌ ，接 种 于 ５ ｍ １ Ｌ Ｂ 培养 基 中， ３ ７ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 中其他 微生 物来源 的木 聚糖 酶一级 结构 进行 比较 ， 同源 。 ｃ 振 荡 培 养过 夜 ； 次 日取 １ ％ 茵液 接 种 到含 ｋ ａ ｍ 的Ｌ Ｂ 培 养基 中， 继 性最 高 达到 了６ ７ ． ８ ％ ，蛋 白三维 结构 模 型如 图２ 所 示 ，组 成 典型 Ｂ 续 振 荡 培养 至 ０ Ｄ ６ ∞ 为０ ． ８ 加入 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ ，２ ５ 。 ｃ 振 荡 培养 １ ２ －１ ６ ｈ ， 离 桶状 结构 。 心 收集 菌体 。
将Ｘ ｙ ｎ Ｂ 的氨 基 酸序 列递 交 至 ｈ ｔ ｔ ｐ ：／ ／ ｓ ｗ ｉ ｓ ｓ ｍ ｏ ｄ ｅ １ ． ｅ ｘ ｐ ａ ｓ ｙ ． 带 有 目的基 因Ｘ ｙ ｎ Ｂ 重 组质 粒 的菌 种 为吉林 农 业科 技 学 院实验 ｏ ｒ ｇ ／ ｔ ｏ ｏ ｌ ｓ ／进行 Ｘ ｙ ｎ Ｂ 氨基酸 序列 分析及 结构 预测 。 室保 藏 。 ２ 结 果与 讨论
１ ． ３ ． ２ 粗酶 液 的制备
１ ． ３ ． １ 目的蛋 白的表 达
将 收 集 的菌 体用 ｌ ０ 倍 缓冲 液 （ ｗ ／ ｖ ）重 悬 ，超 声破 碎 １ ５ ｍ ｉ ｎ
１ ． １ 菌种
Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ通 过Ｄ Ｎ Ｓ 法 对 该
酶进 行酶 学性质表 征 ，当 反应条 件为 ５ ０。 ｃ ，ｐ Ｈ ６ ． ５ 时该酶 具有 最 本实验选取重组质粒ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ ａ — ｘ ｙ ｎ Ｂ ，在Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １ 进行 大活 力 。经 生物 学软 件预 测 该酶 等 电点 为４ ． ８ ２ ，其 氨基 酸序 列 与 表 达 。取 保存 的工 程 菌 ５ ０ ｌ ，接 种 于 ５ ｍ １ Ｌ Ｂ 培养 基 中， ３ ７ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 中其他 微生 物来源 的木 聚糖 酶一级 结构 进行 比较 ， 同源 。 ｃ 振 荡 培 养过 夜 ； 次 日取 １ ％ 茵液 接 种 到含 ｋ ａ ｍ 的Ｌ Ｂ 培 养基 中， 继 性最 高 达到 了６ ７ ． ８ ％ ，蛋 白三维 结构 模 型如 图２ 所 示 ，组 成 典型 Ｂ 续 振 荡 培养 至 ０ Ｄ ６ ∞ 为０ ． ８ 加入 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ ，２ ５ 。 ｃ 振 荡 培养 １ ２ －１ ６ ｈ ， 离 桶状 结构 。 心 收集 菌体 。
将Ｘ ｙ ｎ Ｂ 的氨 基 酸序 列递 交 至 ｈ ｔ ｔ ｐ ：／ ／ ｓ ｗ ｉ ｓ ｓ ｍ ｏ ｄ ｅ １ ． ｅ ｘ ｐ ａ ｓ ｙ ． 带 有 目的基 因Ｘ ｙ ｎ Ｂ 重 组质 粒 的菌 种 为吉林 农 业科 技 学 院实验 ｏ ｒ ｇ ／ ｔ ｏ ｏ ｌ ｓ ／进行 Ｘ ｙ ｎ Ｂ 氨基酸 序列 分析及 结构 预测 。 室保 藏 。 ２ 结 果与 讨论
１ ． ３ ． ２ 粗酶 液 的制备
１ ． ３ ． １ 目的蛋 白的表 达
将 收 集 的菌 体用 ｌ ０ 倍 缓冲 液 （ ｗ ／ ｖ ）重 悬 ，超 声破 碎 １ ５ ｍ ｉ ｎ
木聚糖酶研究进展
山东 食 品发 酵 菘
２ ０ １ ４ ． ４ （ 总第 １ ７ ５ 期）
同 为 ３～ １ ０ 。大 多 数 酶 的 反 应 最 适 ｐ Ｈ 范 围 为
培 养 条件 为 玉米 与小 麦 麸皮 质 量 比为 １ ：１ ， 初
４～ ７ ，最 适 温度 为 ４ ０～ ６ Ｏ ℃ 。基 于 氨基 酸序 列 和疏 水 分析 ，木 聚糖酶 在 糖苷 水解 酶 中被分 成 家 族 １ ０（ 旧称 Ｆ家 族 ）和 家 族 １ １（ 旧称 Ｇ家 族 ） 两 个 家 族 。家 族 １ ０包 含 酸性 木 聚 糖 酶 和 部 分 纤 维 素 酶 。家族 １ １通 常 是 碱 性 木 聚 糖 酶 （ 除 了 一 些 真 菌来 源 的木 聚糖 显 酸 性 外 ）［ ４ － ５ ］ ｏ家 族 ｌ ０的
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｘｙ ｌ ａ ｎ ａ ｓ ｅ ｉ ｓ ｔ ｈ ｅ ｗｉ ｄ ｅ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａｋ ｉ ｎ ｄ ｏ ｆ ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｉ ａ ｌ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｓ ． Ｉ ｔ ｐ ｌ ａ ｙ ａｍ ｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄｍｏ ｒ ｅ ｉ ｍｐ ｏ ￣ａ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｅ
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ： Ｘｙ ｌ ａ ｎ ａ 主链 或 侧 链 上 带 有 多 种 不 同 的取 代 基 。 乙 酰
木 聚糖 （ ｘ ｙ ｌ ａ ｎ）是 一 种 多 聚 五 碳 糖 ，是
基 、葡萄糖残基和阿拉伯糖残基是主链上最常见
的取代 基【 ２ Ｊ 。 木 聚糖 的完 全水 解 需要 木 聚糖 水 解 酶系 中各 种 酶相互 之 间协 同完 成 ，包 括 Ｂ． １ ， ４ ． 内切木 聚糖
酶、 一 木糖苷酶、 ａ— Ｌ 一 阿拉伯糖苷酶、 ｏ． Ｄ ． 葡
木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因(Xyn B)的克隆
木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因(Xyn B)的克隆莫毅;梁方方;赖志强;卢玉发;廖玉英;何仁春;黄丽霞;杨琳【摘要】采用富集培养、透明圈平板筛选的方法,从长期堆放青贮饲料的土壤中分离到7株木聚糖酶产生菌.选取透明圈最大的木聚糖酶产生菌X7作为基础菌,对其进行16S rRNA部分序列PCR扩增测定,经BLAST同源性分析确定X7为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain GD3b(Genebank编码:HM055602.1).然后设计特异引物,以X7基因组为模板,对其进行XynB基因序列PCR扩增,扩增产物经BLAST 同源性分析表明已成功克隆了X7菌株的Xyn B基因,为日后构建木聚糖酶基因酵母表达载体,培育能够分泌表达具有高活性的木聚糖酶酵母工程菌奠定了基础.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2011(000)023【总页数】3页(P20-22)【关键词】木聚糖酶;菌株筛选;16s rRNA;基因克隆【作者】莫毅;梁方方;赖志强;卢玉发;廖玉英;何仁春;黄丽霞;杨琳【作者单位】广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院;广西人口和计划生育研究中心,广西畜牧研究所华南农业大学动物科学学院【正文语种】中文【中图分类】S816.7木聚糖是一种由β-1，4-木糖苷键连接形成并带有多种取代基的多聚糖，主要存在于植物细胞壁中，在自然界中是除纤维素之外第二丰富的可再生物质资源（Prade，1995）。
发酵液中木聚糖酶的纯化和性质的研究
纯酶在 ４ ℃以下较稳 定 ， ｐ ． ～９０范 围 内稳 定 ；ｄ 对 该 酶有 促进 作 用 ， ｎ ｐ２ Ｓ２ ５ 在 Ｈ５０ ． ｃ Ｍ２ ｂ 、 、ｎ 有较 强 的抑 制 作 用 ； 分 子 量 为 ２． 其 ６８ ｋ ａ该酶在波 长 ２０和 ２０Ｂ 处分 别有最 小和最 大吸 收峰 ， 典型 的蛋 白质特 征吸 收峰 ， Ｄ； ５ ８ ｉ ｎ 是 它在 ２０ ２０ｎ 范 围 内有 一 个很 大的 吸收 ０ — ３ ｍ 峰 ； 的等电点为 ４２为酸性蛋 白质 ； ｍ为 ９２ Ｉ。［ 该酶 ．， Ｋ ． ｌ 结论 ］ 究为研 究木 聚糖 酶 的功能与应 用奠 定 了基础 。 ｌ Ｉ 该研
摘要 ［ 目的］ 为克 隆木 聚糖酶基 因和 构建基 因工程 茵提 供重要 的 生物信 息。［ 法］ 方 曲霉 固态发 酵经硫 酸铵 盐析 、 水层 析 、 疏 凝胶 过滤
层析 和 阴 离子交换层 析等提 纯步骤 ， 获取 纯 的木聚糖 酶并对 其性质进行 研 究。［ 结果 ］ 酶 的最适反应 温度为 ５ 该 ｏ℃ ， 最适反 应 ｐ Ｈ为４．； ５
ｉ ．【 ｅｕｔ １ ｅｏｔｒｍ ａｔ ｎｔ ｒ ｍｔｒ ｆｈ ｌｎ ｅ ａ ０ｏ ｎ ｔ ｏｔ ｕ ｒ ｃ ｏ Ｈｗ ｓ ５ ｈｅｐｒ ｎｙ￣ ｗ ｓ１ １ ｔ ｌ ｅ ｗ ｅ Ｒ ｓｌＪ ｈ ｐｉｍ ｒ ｃｉ ｅ ／ ｕｅｏ ｔ ｘ ａａ ｗ ｓ５ ａｄｉ ｐｉ ｍ ａ ｔｎｐ ａ ４．；ｔ ｕｅｅｚｎ ａ ／ ￣ｓ ｂｅｂ ｌ ｄ ｒ ｅ ｏ ｎ￣ ｅｙ ｓ Ｃ ｓ ｍ ｅｉ ｉ ｏ ａ ｏ ４ Ｃ ａｄｉ ｅｒ ｇ ｆｐ ５０—９Ｏ ｄ ｈｄｐｏ ｏｉ ｆ ｔ ｎ ｔ ｎｙ ｅａｄＭｎ ， ５ｏ ｔ ａ ｅｏ Ｈ ． ｎ ｎｈ ｎ ．；ｃ ａ ｒｍ ｔｎ ｅｅ ｅｅｚｍ ２ ｏ ｃ ｏ ｈ ｎ ａｄＳ２ ｈｄｓｏｇｒｉｈ ｉｒ ｆ ｔ ｎｉ ｔ ｎ ｎ ａ ｔ ｎｅ ｉ ｔｙｅｅ ；ｉ ｒ ｎ ｂｏ ｃ ｏ ｔ ｓ
木聚糖酶生产及酶学性质的研究
木聚糖酶生产及酶学性质的研究一、本文概述木聚糖酶是一类能够水解木聚糖及其相关多糖的酶类，广泛存在于自然界中，尤其是在植物、微生物和动物体内。
由于其在生物质转化、食品加工、饲料工业以及医药等领域的重要应用价值，木聚糖酶的研究与生产日益受到关注。
本文旨在全面综述木聚糖酶的生产方法、纯化技术以及酶学性质的研究进展，以期为木聚糖酶的进一步研究和应用提供理论支持和实践指导。
本文将对木聚糖酶的生产方法进行详细阐述。
这包括从天然来源中提取木聚糖酶，以及通过微生物发酵、基因工程等生物技术手段生产木聚糖酶。
在此基础上，还将探讨不同生产方法的优缺点，以及影响木聚糖酶产量的关键因素。
本文将关注木聚糖酶的纯化技术。
纯化是获得高质量、高活性木聚糖酶的关键步骤，本文将介绍常见的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等，并分析各方法的优缺点及适用范围。
本文将重点研究木聚糖酶的酶学性质。
这包括木聚糖酶的分子量、最适pH值、最适温度、动力学参数等基本性质，以及酶的稳定性、抑制剂和激活剂等影响因素。
通过对这些酶学性质的研究，可以更深入地了解木聚糖酶的作用机制和催化性能，为其在各个领域的应用提供理论依据。
本文旨在通过系统研究木聚糖酶的生产及酶学性质，为木聚糖酶的进一步研究和应用提供全面、深入的理论支持和实践指导。
二、木聚糖酶的生产方法木聚糖酶作为一种重要的工业酶，其生产方法主要包括微生物发酵法、化学合成法和基因工程法。
其中，微生物发酵法因其产量高、成本低、条件温和且易于工业化生产等优点，成为目前木聚糖酶生产的主要方法。
微生物发酵法生产木聚糖酶主要利用能够产生木聚糖酶的微生物，如真菌、细菌和放线菌等，通过优化培养基成分、发酵条件和菌种选育等手段，提高木聚糖酶的产量和活性。
目前，黑曲霉、米曲霉和里氏木霉等真菌是木聚糖酶的主要生产菌种。
在发酵过程中，碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养成分对木聚糖酶的产量和活性具有重要影响。
常用的碳源包括木聚糖、葡萄糖、果糖等，氮源则包括蛋白胨、酵母粉、豆饼粉等。
两种不同固定化方法对木聚糖酶Xyn11A酶学性质的影响及在低聚木糖制备中的应用
两种不同固定化方法对木聚糖酶Xyn11A酶学性质的影响及在低聚木糖制备中的应用李婵娟;汪松波;吴高兵【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2024(50)10【摘要】为了提高木聚糖酶Xyn11A的稳定性及在低聚木糖生产中的应用潜力,该研究利用有机-无机杂化纳米花技术和以氨基乙基-琼脂糖为载体共价结合法固定Xyn11A,制备了固定化酶Xyn11A-Cu_(3)(PO_(4))_(2)和Xyn11A-Agarose,并比较研究了2种固定化酶的酶学性质,发现2种固定化酶的pH稳定性和热稳定性均有所提高,Xyn11A-Agarose稳定性更佳,在pH 4.0~4.5处理24 h后仍有40%~65%的残余活性,50℃处理3 h后仍有60%的残余活性。
以榉木木聚糖为底物,与游离酶相比,Xyn11A-Cu_(3)(PO_(4))_(2)和Xyn11A-Agarose对底物的亲和力和催化效率有所降低,但有较好的重复使用次数。
特别是Xyn11A-Agarose循环使用12轮后,仍有90%的残余活性。
Xyn11A-Cu_(3)(PO_(4))_(2)水解甘蔗渣和玉米芯粉生成的低聚木糖中木二糖和木三糖含量最高,木四糖含量最低;而Xyn11A-Agarose催化生成的不同低聚木糖含量相当。
2种固定化方法均能显著提高Xyn11A的稳定性,但Xyn11A-Agarose的稳定性和重复性优于Xyn11A-Cu_(3)(PO_(4))_(2),表明Xyn11A-Agarose在生产低聚木糖中具有更大应用潜力。
【总页数】7页(P17-23)【作者】李婵娟;汪松波;吴高兵【作者单位】武汉设计工程学院食品与生物科技学院;华中农业大学生命科学技术学院;华中农业大学植物科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.利用木聚糖酶酶解小麦麸皮制备低聚木糖工艺参数的研究2.重组木聚糖酶酶解玉米芯制备低聚木糖3.嗜热木聚糖酶的克隆表达及其在酶解生产低聚木糖中的应用4.卷须链霉菌D-10 木聚糖酶酶解玉米芯汽爆液制备低聚木糖的研究5.内切木聚糖酶的选择性纯化及酶解制备低聚木糖的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
木聚糖酶的研究进展
木聚糖酶的研究进展陈洪洋;蔡俊;林建国;王常高;杜馨【摘要】木聚糖是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源,通过筛选出产木聚糖酶的菌株,利用基因工程技术,将木聚糖酶基因进行异源表达,提高木聚糖酶产量.该文综述了菌株产生的木聚糖酶酶学性质,并对酶学性质进行改善使木聚糖酶更符合应用的条件,同时研究木聚糖酶分离纯化的步骤,来提高木聚糖酶的酶活.文章重点介绍了木聚糖酶的产生菌和木聚糖酶在基因工程技术等方面研究进展,并对木聚糖酶的分离纯化方法做了简要地介绍.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)011【总页数】6页(P1-6)【关键词】木聚糖酶;基因工程;酶学性质;分离纯化【作者】陈洪洋;蔡俊;林建国;王常高;杜馨【作者单位】湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068【正文语种】中文【中图分类】Q814.9木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等农作物废弃物中，由于木聚糖酶能够将木聚糖分解成不同长度的低聚木糖和木糖，该产物具有重要的经济价值，通过木聚糖酶将这些可利用资源充分利用，发挥其潜在的应用价值，木聚糖酶的研究也受到充分的重视。
现在木聚糖酶已广泛应用于造纸、食品、饲料和能源等领域，带来了很大的经济效益。
目前木聚糖酶的生产主要来源于微生物发酵，对发酵得到的木聚糖酶的酶学性质进行研究，以便了解该酶的应用范围，使木聚糖酶在工业应用中发挥其巨大的潜能，增加更多的经济效益，为各领域的发展做出更大的贡献。
木聚糖酶 xynB 基因序列分析及表达载体构建
木聚糖酶 xynB 基因序列分析及表达载体构建常桂英;王俊玲;徐亚维;杨闯;刘盼想【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2013(000)010【摘要】木聚糖酶在快速降解木聚糖类半纤维素的过程中起重要作用。
Prevotella ruminicola B菌株中带有多种木聚糖酶基因，所产酶类具有潜在的应用前景。
利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ将xynB连接至表达载体 pET-28a 中，与组氨酸标签融合表达构建重组质粒pPrxynB，现已在大肠杆菌中获得高效表达。
经分析XynB既具有外切酶活力，又具有β-木聚糖苷酶活力，因此XynB在木糖制备中具有重要的工业应用价值。
【总页数】2页(P31-32)【作者】常桂英;王俊玲;徐亚维;杨闯;刘盼想【作者单位】吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101;吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101; 吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，吉林长春130023;吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101;吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101;吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101【正文语种】中文【中图分类】Q556+.2;Q786【相关文献】1.木聚糖酶XynB-E18的重组表达纯化及酶学性质测定 [J], 宋迎;高伟;鲁芳;严孝金;张蓓;刘永;张立;孟昆;杨培龙;姚斌2.黑曲霉木聚糖酶基因xynB在大肠杆菌中的表达及重组木聚糖酶的特性 [J], 邓萍;曹云鹤;陆文清;郭小华3.变形假单胞菌精氨酸脱亚胺酶基因序列分析及其表达载体构建 [J], 李振伟;倪晔;郑璞;刘咏梅;徐岩;孙志浩4.木聚糖酶基因(XynB)肠道特异表达载体的构建及鉴定 [J], 涂枫;赵为民;曹静;方晓敏;陈哲5.α-葡萄糖苷酶基因序列分析及真核表达载体构建 [J], 王继瑞;张云开;覃晓娟;李玮;梁智群因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
木聚糖酶的研究进展及其应用
木聚糖酶的研究进展及其应用付冠华;李端;周晨妍;丰慧根【摘要】The application status and research focus of xylanase infeed,food,paper making and energy fields were summarized,and its application prospect was forecasted.%综述了木聚糖酶在饲料、食品、造纸及能源等领域的应用现状与研发热点,展望了木聚糖酶的应用前景.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)035【总页数】3页(P21566-21568)【关键词】木聚糖酶;催化机制;基因克隆【作者】付冠华;李端;周晨妍;丰慧根【作者单位】新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡453003;新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡453003;新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡453003;新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】S132木聚糖(Xylan)是植物半纤维素的主要成分，是除纤维素外自然界中存在的最丰富的多糖。
木聚糖酶广泛存在于动物、植物和微生物中，该酶通常以随机方式作用于木聚糖主链，将其降解为低聚木糖和木糖。
广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，包括多种内切酶和外切酶。
但通常所说的木聚糖酶仅限于内切β-1，4-D-木聚糖酶(endo-β-1，4-D-xylanase)［EC.3.2.1.8］，该酶是木聚糖降解酶系中最关键的酶，也是目前木聚糖酶研究的热点［1-3］。
1 木聚糖酶的研究进展国际上有关微生物木聚糖酶的诱导与调节机理，酶的提纯、鉴定方法，以及木聚糖酶基因分子的克隆与表达研究较多。
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南京工业大学硕士学位论文耐热木聚糖酶（XYNB）的分离纯化与性质研究姓名：孙雷申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：韦萍;李环20060601摘要木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。
木聚糖结构复杂，它的完全降解需要多种水解酶的共同作用。
内切-β-1,4-木聚糖酶（1,4-β-D-木聚糖水解酶，EC3.2.1.8）以内切的方式作用于木聚糖的主链，产生不同链长的寡糖及少量的木糖，是木聚糖降解酶系中关键的酶。
木聚糖酶的耐高温和热稳定性是工业化应用的理想特性，在生物转化、制浆造纸，食品饲料等工业中存在很大的应用潜力。
本文综述了木聚糖酶的分离纯化技术以及性质和结构研究进展，研究了重组大肠杆菌1020产生的耐热木聚糖酶（XYNB）的纯化方法与性质。
采用不同的破碎方法，对表达的木聚糖酶在细胞中的分布进行分析，确定了表达的耐热木聚糖酶XYNB主要分布中可溶性细胞质中。
纯化前对表达的酶进行细胞定位是本论文的一个特色。
XYNB是胞内酶，采用反复冻融和超声波联合的方法破碎，发现对湿菌泥反复冻融三次后，酶的释放量最大；50 mL 20%的菌悬液，采用500 W，间歇时间10 s，超声波破碎15 min后，酶的释放量最大。
利用热变性除去杂蛋白，选择变性温度70℃，时间30 min，回收率可达到69.4%，纯化倍数4.9。
结合Ni-NTA 亲和层析，采用梯度洗脱方法，一步得到电泳纯XYNB，回收率29.4%，纯化倍数13.4。
采用热变性和一步亲和层析分离得到电泳纯的耐热木聚糖酶XYNB，简化了分离纯化步骤，是本论文的一个特色。
酶学性质研究表明XYNB的最适pH在6.5左右，在pH 6.0-10.0能保持最高活力的60%以上，在pH值低于6.0和高于10.0时，活力显著下降。
在50-100℃范围内，酶催化活力随着温度的升高不断上升，酶在80-100℃范围内表现出50%以上的酶活力。
在pH8.0，70℃，保温6 h后，酶活力变化不大；100℃保温1.5 h 后，残余50%的酶活力。
1mmol/L Hg2+显著影响酶活力，其它金属阳离子和EDTA 对酶活的影响不大。
XYNB对Oat spelt xylan 酶促反应的K m为0.23 mg/mL，最大反应速度V max为0.36 μmol/(min﹒mL)。
采用生物信息学手段分析XYNB的序列和结构，发现XYNB属于F/10族，与Thermotoga sp. strain FjSS3-B.1的xyn A有85%一致性，与Thermotoganeapolitana的xylanase B有83%一致性。
XYNB序列中Glu647(E727)，Glu753(E862)，His598(H656)，Trp602(W660)是保守的，对酶表现活力有重要影响。
XYNB前19个氨基酸构成酶的信号肽。
整个肽链折叠成β/α桶形，这与大多数F/10族的结构相似。
分析XYNB的氨基酸组成与结构，并与其它木聚糖酶比较，发现XYNB中不稳定氨基酸（Ser, Thr, Cys, Asn, Gln）含量低，Pro的含量高于嗜温木聚糖酶，结构上含有较多的离子对，以及低的溶剂可及疏水表面积和高的带电残基溶剂可及表面积，这些因素稳定了酶的构象，增强了酶的热稳定性。
采用化学修饰的方法讨论酶的必需氨基酸，进一步证实了Trp, Glu是酶表现活力的必需氨基酸，Trp对底物和酶的结合起关键作用，Glu是酶表现活力的重要氨基酸。
对His, Cys, Ser的修饰后，酶活力变化不明显，这些氨基酸对酶的构象或活性影响不大。
WRK修饰的XYNB热稳定性下降，进一步证明了离子对对酶热稳定性的重要作用。
在序列和结构分析的基础上对保守氨基酸进行化学修饰，提高了化学修饰的针对性，同时从序列和结构的角度对化学修饰的结果进行合理的解释，这是本文的一个创新点。
关键词：耐热木聚糖酶分离纯化酶学性质序列和结构化学修饰ABSTRACTXylan is a major component of hemicellulose fraction of the plant walls, second to cellulose in natural abundance. The backbone may carry various substitutions and its depolymerization is accomplished by the action of endo-xylanases and other enzymes. Xylanase can hydrolyze β-1, 4-glycosidic linkages of the xylan backbone to produce short chain xylo-oligosaccharides of various length. Hence endo-β-xylanase is the crucial enzyme component of microbial xylanolytic systems. The character of high temperature resistance and thermostability is good for industry applications, such as in biotransformation, paper pulp, food and feedstuff.In the present dissertation, the separation and purification methods of xylanase were summarized, including the properties and structure investigation. Thermostable xylanase XYNB from bioengineering E.coli 1020 was investigated.Different methods of disruption were used to determine the location of expressed XYNB, and the main fraction of xylanase was in soluble cytoplasm. It is a character of locating the expressed enzyme in cell before separation.XYNB was an enzyme in the cell. Repeated freezing and thawing, as well as ultrasonic disruption were used in destroying the cell. Three times of repeated freezing and thawing were the best in XYNB releasing. 50 mL cell solution with the concentration of 20% was disrupted by 500 W, with the intermittent time of 10 s and total time was 15 min. Heat treatment was used to concentrate the crude enzyme solution, and the purified factor was 4.9 with enzyme recovery of 69.4%. XYNB was purified with Ni-NTA immobilized metal affinity chromatography using gradient eluting style, and the purified factor was 13.4 with the recovery of 29.4%. It is characteristic of purifying XNNB to electrophoresis purity by combining heat treatment and affinity chromatography.℃h pH of 6.0 to 10.0, the activity The optimum pH was 6.5 (at 70), and withold 60% of the maximum. The activity was inceasing with the elevating temperature between 50-100℃, and the activity was above 50% of the maximum between the℃2+of 1mmol/L concentration inhibited the activity heavily, temperature of 80-100. Hgand EDTA had no influence on the activity of XYNB. The K m and V max of the enzyme catalyzing oat spelt xylan were 0.23 mg/mL and 0.36 μmol/(min﹒mL) individually.Amino acid sequences and structure of XYNB were analyzed by bioinformatics methods. XYNB was belonged to F/10 glyco-hydrolyzing enzyme, and of 85% identity with xyn A of Thermotoga sp. strain FjSS3-B, 83% identity with xylanase B of Thermotoga neapolitana. Glu647(E727), Glu753(E862), His598(H656), Trp602(W660) were conserved in the evolution of the xylanases. The front 19 amino acids formed a single peptide. The structure of XYNB was a β/α barrel. The low unstable amino acids (Ser, Thr, Cys, Asn, Gln), and high proline of XYNB were contributed to the thermostability. Salt bridges were important in stabilizing the structure and low accessible solvent areas (ASA) and high exposed charged ASA contributed the themostability.Chemical modification was used to determine the important amino acids related to activity and thermostability. Tryptophan and glutamic acid were important in the enzyme activity. Tryptophan was the binding amino acid with the substrate, and glutamic acid was the active site. Modification of Histidine, Cysteine, Serine had little influence in activity. Glutamic acid is crucial in high temperature resistance. That chemical modification was based on the analysis of sequence and structure elevated the pertinence of certain amino acid modification. And explanations were given to the chmical modification results. These were characteristics of this dissertation.KEYWORDS: Themostable xylanase；Separation and purification；Enzymic property；Sequence and structure；Chemical modification南京工业大学学位论文独创性声明及使用授权的声明一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。