基因工程(一轮复习)

mRNA反转录 DNA合成仪
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗
传给下一代 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 ②基因表达载体的组成
RNA聚合酶
转录 转录
目的基因
③构建过程
同种限制酶
DNA连接
(3)将目的基因导入受体细胞
受体细胞种类不同，导入方法不同
常用类型 来源
功能 结果
E· coli DNA连接酶 大肠杆菌 __________
T4 DNA连接酶 T4噬菌体
黏性末端 只“缝合”__________
黏性末端和平 “缝合”_____________
末端 _______
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的___________ 磷酸二酯键
(3)载体
工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能 →蛋白质应有
的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→推测应有的氨基酸序 列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
2.( 教材 P26 旁栏思考题解答 ) 对天然蛋白质进行改造，你认为应 该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？
提示
毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改
2.(教材P4“寻根问底”改编)根据你所掌握的知识，你能分析出
限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
提示 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物
在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来 病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源
DNA 侵入时，会利用限制酶将外源 DNA 切割掉，以保证自身
③结果：产生 黏性末端
或平末端。
如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是
GAATTC
，
切割位点在
CCCGGG 专一性 。
G和 A
之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是
G和 C 之间；说明限制酶具有
，切割位点在
(2)DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段 拼接成DNA分子 。 ②类型
基因工程
[最新考纲] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。 2.基因工程的原理及技术( 含 PCR 技术Ⅱ ) 。 3. 基因工程的应用 ( Ⅱ ) 。 4. 蛋白质工程 ( Ⅰ ) 。
5. 实验：DNA的粗wenku.baidu.com取与鉴定。
考点一
基因工程的基本工具及操作过程
1.基因工程的基本工具 (1)限制性核酸内切酶(限制酶) ①来源：主要从 原核 生物中分离纯化而来。 ②作用：识别 特定的核苷酸序列 并切开特定部位的两个核 苷酸之间的 磷酸二酯键 。
的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使 之失效，从而达到保护自身的目的。
3.(教材P6“旁栏思考题”解答)想一想，具备什么条件才能充当 “分子运输车”？ 提示 能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因及对
受体细胞无害等。
1.(2016· 全国课标卷 Ⅰ ， 40) 某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的基因失活 (Ampr 表示氨苄青 霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体 用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，
生物种类
常用方法 受体细胞
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法 _____________
体细胞或受精卵
显微注射法 _____________
_____________ 受精卵
转化法 _____________
原核细胞 Ca2＋处理细胞→ 感受态细胞→重
将目的基因插入到Ti 将含有目的基因的
质粒的T－DNA上→ 表达载体提纯→取
双链环状DNA分子
限制酶切 割位点 标记基因
②其他载体：λ噬菌体衍生物、
动植物病毒 等。
③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
(1)基因工程2种工具酶的化学本质分别是什么？运载体的种类有 哪些？ 提示 限制酶、 DNA 连接酶其化学本质均为蛋白质。运载体的
种类有质粒(常用)、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
解析
(1) 作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而
在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组 DNA 的鉴定 和选择；③具1或多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在
含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有 Ampr的大肠杆菌才能够
生长。而 Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因 的大肠杆菌细胞中无 Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有 质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有 Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体 的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含 有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以 区分。 (3) 噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成 DNA，需
这是目的基因能否在真核细胞内稳定遗传的关键；其次，利用
____________法检测目的基因是否转录出相应的mRNA；最后， 利用____________法检测目的基因是否翻译成蛋白质。 答案 (1) 能识别特定的脱氧核苷酸序列并且在特定位点切开 (2)DNA 连接酶 基因表达载体的构建 (3) 氯化钙
DNA探针 制作特定__________ ____________ 基因诊断 碱基互补配对
与病人样品DNA混合， 临床应用 分析杂交带情况
2.蛋白质工程 (1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作： 基因修饰 或基因合成。 ③结果： 改造了 现有蛋白质或制造出 新的蛋白质 。 ④目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对 蛋白质结构 进行分子设计。
(3)诠释基因表达载体
(4)农杆菌转化法原理 植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上 的T－DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上
(若将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，则目的基因将被一
起带入)
考点二
1.基因工程的应用
基因工程的应用及蛋白质工程
(1)动物基因工程：用于提高动物 生长速度 从而提高产品产 量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产 药物 ； 用 转 基因动物作器官移植的 供体 等。 抗逆 品质 (2)植物基因工程：培育 抗虫 转基因植物(如抗虫棉)、______ 抗病
提示
适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适
合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的 识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作 载体。
2.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要指 编码蛋白质 的基因，也可以是一些具 调控 作用的因子。 基因文库
(2)限制酶为何不切割自身DNA? 提示 限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序
列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身 DNA 的原 因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)限制性核酸内切酶 Mun Ⅰ和限制性核酸内切酶 EcoR Ⅰ的识 ↓ ↓ 别序列及切割位点分别是 和 。如图 —CAATTG— —GAATTC— 表示四种质粒和目的基因， 其中箭头所指部位为限制性核酸内切 酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目 的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。
(2)操作过程 从预期的蛋白质 功能 出发→设计预期的 蛋白质结构 脱氧核苷酸序列 →
推测应有的 氨基酸序列 →找到相对应的
(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。其流程图如下：
1.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？ 提示 基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→
折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质
________(答出两点即可 )，而作为基因表达载体，除满足上述基 本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2) 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠 杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分
的，其原因是______________；并且________和________的细胞
加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠
杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大 肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含 有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1) 质 粒 载 体 作 为 基 因 工 程 的 工 具 ， 应 具 备 的 基 本 条 件 有
借助宿主细胞完成DNA复制。
答案
(1)能自我复制、具有标记基因
(2) 二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒 (或答含有重组
质粒)
长
二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生
四环素
(3)受体细胞
2.如图为农杆菌转化法示意图。请回答以下问题：
造，主要原因如下： (1) 任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对 蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如 果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分
子还是无法遗传的。 (2) 对基因进行改造比对蛋白质直接改造
要容易操作，难度要小得多。
1.(2015· 全国卷 Ⅱ， 40) 已知生物体内有一种蛋白质 (P) ，该蛋白 质是一种转运蛋白，由 305个氨基酸组成。如果将 P分子中 158
也是不能区分的，其原因是 _____________ 。在上述筛选的基础
上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落， 还需使用含有________的固体培养基。 (3) 基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA复
制所需的原料来自于____________________________________。
转化过程
导入农杆菌→侵染植 卵(受精卵)→显微注 组表达载体与感 物细胞→整合到受体 射→受精卵发育→ 细胞的染色体DNA上 获得具有新性状的 →表达 动物 受态细胞混合→
感受态细胞吸收
DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
1.下列物质或过程哪一项不影响磷酸二酯键数目变化？请逐项分 析说明。 ①RNA聚合酶、逆转录酶、Taq酶 ②DNA聚合酶、DNA连接 酶、DNA酶 ③遗传信息的翻译、PCR中DNA解链 ④cDNA文库的构建、基因突变过程 提示 ③ RNA聚合酶、逆转录酶和Taq酶的作用都会导致磷 酸二酯键的数量增加， DNA 聚合酶和 DNA 连接酶的作用都会 导致磷酸二酯键的数量增加，而DNA酶的作用会导致磷酸二酯 键的数量减小，遗传信息的翻译会增加肽键的数目， PCR 中 DNA解链会减少氢键的数目，这两个过程都不会影响磷酸二酯 键的数目， cDNA文库的构建需要使用逆转录酶，这会导致磷 酸二酯键数目增加，基因突变是指基因中碱基对的增添、缺失 和替换，其中增添和缺失会导致磷酸二酯键数目改变。
转基因植物(如转基因烟草)和
番茄)；利用转基因改良植物的
转基因植物(如抗寒
(如新花色矮牵牛)。
(3)比较基因治疗与基因诊断： 原理 操作过程 正常基因 导入 利用__________ 基因治疗 基因表达 ____________ 有基因缺陷的细胞中， 以表达出正常性状来 治疗(疾病) 临床实验 进展
(1)图中①过程用到的工具酶的特点是________________ (2)图中②过程用到的工具酶是____________，该过程是基因工 程最核心的步骤，即____________。
(3) 图中③过程，需使用 ________ 溶液处理农杆菌使其成为感受 态。 (4)图中④过程的原理是____________。 (5)检测基因工程是否成功。首先，应检测 _________________，
DNA 分子
(4) 植物细胞的全能性
基因 分子杂交
(5) 转基因生物的染色体上是否插入目的
抗原—抗体杂交
(1)诠释基因组文库与部分基因文库
(2)诠释PCR技术 ①原理：体外DNA复制 ②需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA
聚合酶(Taq酶)
③过程： DNA 受热 (90 ～ 95 ℃ ) 变性解旋为单链、冷却 (55 ～ 60 ℃)后RNA引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合 酶作用下延伸(70～75 ℃)合成互补链。