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酵母双杂合的原理
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）是一种在真核生物细胞内检测蛋白质之间相互作用的技术，其原理基于真核生物转录因子的模块性。
在酵母双杂交系统中，通常将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到含DNA结合结构域（如GAL4的BD，Binding Domain）和转录激活结构域（如GAL4的AD，Activation Domain）的酵母表达质粒中，构建成融合表达载体。
然后将这两种融合表达载体转化到同一个酵母细胞中，如果待研究的两种蛋白质之间存在相互作用，那么它们就可以将BD和AD拉近，形成一个有功能的转录因子，从而激活报告基因的表达。
具体来说，酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达来探测蛋白质之间的相互作用。
系统由三个部分组成：
1. 与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称为诱饵蛋白（bait protein）。
2. 与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称为猎物蛋白（prey protein）。
3. 带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
菌株具有相应的缺陷型、抗性基因，有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
在酵母细胞中，如果两种蛋白质之间存在相互作用，那么它们就可以将BD和AD拉近，形成一个有功能的转录因子，从而激活报告基因的表达。
通过对报告基因表达的测定，可以确定待研究的两种蛋白质之间是否存在相互作用。
酵母双杂交系统具有灵敏度高、操作简便、可用于高通量筛选等优点，因此在蛋白质组学、分子生物学等领域得到了广泛应用。
同时，酵母双杂交系统也可以用于研究蛋白质之间的功能关系、蛋白质相互作用网络等方面的问题。
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中，基因互作是一个重要的研究领域，对了解基因的功能，及其在生物学中的重要性具有关键性意义。
近年来，越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。
其中，大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。
1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）最早是由Fields与Song在1989年提出的，它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。
大肠杆菌酵母双杂交系统（E. coli yeast two-hybrid system）是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。
它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体，并在其上构建相应的表达基因来实现的。
通过这种方法，大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，并通过一些方法进行确认和鉴定。
2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点（1）鉴定简单：大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体，而不需要其他繁琐的操作，使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。
（2）兼容成熟技术：大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的，因此，其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。
大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。
（3）识别特异性高：大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高，能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。
3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。
例如，研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的，就需要找到与之相关的其他基因，以了解它们之间是否发生了相互作用。
在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。
此外，大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。
例如：通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究，有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。
酵母双杂交技术酵母双杂交技术¾酵母双杂交系统( two-hybridsystem) 也叫相互作用陷阱( interaction trap)，是1989年由Song和Field基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统建立的。
¾酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。
在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。
Stanley Field酵母双杂交技术的提出2.酵母双杂交原理介绍酵母中，半乳糖代谢所需的基因被两个调节蛋白所控制：GAL4，GAL80当存在半乳糖时，GAL4蛋白与UAS上游的基因中的GAL4效应元件结合，激活转录。
不存在半乳糖时，GAL80结合GAL4阻碍转录激活。
2.酵母双杂交原理介绍完整的酵母转录因子GAl4分为结构上可以分开的、功能上又相互独立的2个结构域。
一个是位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain, DNA-BD）。
另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain，AD）。
酵母双杂交技术原理很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
酵母双杂交系统组成酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)；(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)；(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和绿色荧光蛋白等2.酵母双杂交原理介绍一个酵母双杂交系统包括3个部分：带有1个或多个报告基因的宿主菌株；与GAL4-BD 融合表达蛋白，被表达的蛋白称为旅馆诱饵蛋白（bait）；GAL4-AD 融合表达载体，被表达的蛋自称为靶蛋白（prey）。
酵母双杂交的原理
酵母双杂交(YeastTwo-hybridSystem，Y2H)是一种具有实验性方法的蛋白质相互作用实验，它可以用来验证和确定两个蛋白在体内及体外之间存在相互作用。
这种蛋白质相互作用可以发生在体内，也可以发生在体外。
在这种实验中，使用的物质是由两个融合的蛋白质组成的双融合蛋白，一个蛋白是结合调控区或结合位点，另一个蛋白质是响应元件，它可以检测到调控区里结合的物质的存在，从而启动一系列的反应，其结果是显示双杂交蛋白中调控区是否与响应元件相结合。
二、酵母双杂交的原理
酵母双杂交的基本原理源于酵母菌的基因调控机制。
它的基本原理是，将一个结合调控区的蛋白（称为“结合蛋白”）与一个响应元件（称为“受体蛋白”）结合起来，当结合蛋白结合到调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会对外在的细胞因子做出反应。
当结合蛋白结合调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会产生一种光变化，从而表明蛋白质之间存在相互作用。
简单地说，酵母双杂交的原理是利用双融合蛋白将一个结合调控区的蛋白和一个响应元件结合在一起，当结合调控区的蛋白结合到结合调控区时，响应元件就会激活，酵母细胞就会产生一些外在细胞因子，如光变化。
从而可以检测到蛋白质之间发生相互作用。
三、酵母双杂交的应用
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用来验证和确定蛋白质之
间的相互作用，也可以用来研究蛋白的结构和功能，并有助于发现新的药物靶标。
此外，它也可以用于研究基因调控机制，研究染色体的结构，以及研究蛋白质和核酸之间的相互作用等。
蛋白质相互作用的研究技术蛋白质相互作用是生物学研究中非常重要的一部分，因为它们决定了生命体系的许多方面，包括代谢、信号传递、免疫系统等等。
我们现在已经掌握了许多研究蛋白质相互作用的技术，下面我将向大家介绍其中一些最常用的技术。
1. Yeast two-hybrid 系统其中一个最经典的技术是酵母双杂交（yeast two-hybrid）系统。
这个技术建立在分离的DNA结合因子的研究的基础上，可以用于鉴定在活菌中两个蛋白质之间的相互作用。
这个系统包含了两个向量，各自含有一个蛋白质位（bait）和一个激活域（activation domain）。
在酵母细胞内，如果两个蛋白相互作用，那么它们就会与两个向量中的蛋白位结合并激活报告基因。
这个系统的优点是可以用来筛选大量蛋白相互作用，但是它也存在着很多技术限制，包括许多假阳性结果以及只能够进行体外实验等。
2. 活细胞荧光共振能量转移在本世纪初，生物学家们提出了一种新的相互作用检测技术——活细胞荧光共振能量转移（FRET）方法。
这个技术允许研究者在活细胞内非破坏性地观察蛋白质相互作用。
FRET基于感应荧光转移的原理，其中某种荧光染料（典型地是青蛋白和黄蛋白的荧光蛋白）被用作捕捉分子，取代了盈余的分子。
如果这两种染料接近，捕捉的黄色荧光就会受到蓝色荧光的兴奋态激发，并且可见光释放出能量变为绿色光。
这个方法可以通过光学显微镜来观察细胞中光谱成分的变化，从而证明有哪些分子相互作用。
由于活细胞荧光共振能量转移可以在细胞内部进行，使其具有无与伦比的优势，尤其是在体内试验中获得成功。
3. 质谱相互作用分析质谱相互作用分析（mass spectrometry-based interactomics）相对于其他无损方法更微不足道，它可以检测和鉴定蛋白之间的相互作用。
质谱相互作用分析就是要首先在细胞质中富集出一个基因编码的蛋白复合物，再将这个复合物分离开来，通过蒸馏、凝胶过滤等技术将它们分离成单独的蛋白质单元，然后将它们进行电泳，然后通过质谱仪来分析，这个技术在体外实验中被广泛使用。
