细胞贴片免疫组化染色步骤

（六） Envision技术
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶 （Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术 1．基本原理
2、操作步骤
（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗； （2）用3% H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗 ； （3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ； （4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃ 1h ； （5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃ 30min ；
用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体 ， 具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感 。敏感，简便。
2、操作步骤
（1）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗； （2）用3% H2Ｏ2甲醇液阻断15min，水洗，PBS洗； （3）抗原修复处理，PBS洗； （4）正常山羊血清封闭 15min；
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin ）技术：
S-P （ streptavidin －peroxidase）技术
SABC （streptavidin-biotin complex）技术
1、基本原理
2、操作步骤
（1）常规切片脱蜡至水 ； （2）必要时抗原修复：如高温高压修复； （3）3% H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ； （4）水洗，PBS洗， 10%牛血清白蛋白20min ；பைடு நூலகம்（5）加一抗 4℃过夜或37℃孵育1h ； （6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃ 30min ； （7） PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素 （SABC），37℃ 孵育20min ； （8）DAB/H2Ｏ2显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。
（6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素
和酶标生物素 混合，稀释配制成 ABC复合物 ), 37℃ 20min ； （7）PBS洗，经DAB/H2O2显色 ； （8）常规脱水，透明，中性树胶封固。
3、ABC法的优点
（1）敏感性高 :结合力强,分子量小; （2）特异性强，背景染色淡 ； （3）方法简便，节约时间 ； （4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于 双重或多重免疫染色 。
（7） PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37℃孵育 20min； （8） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （9） PBS洗后，DAB/H2Ｏ2显色； （10）苏木素衬染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。
（六） Envision技术
１、原理
（5）滴加第一抗体，37℃ 孵育1h；
亲和免疫组化技术
(Affinity cytochemistry﹠histochemistry technique)
亲和的概念
物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、
生物素与抗生物素（又称亲和素）、葡萄球菌A蛋白
与IgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素
与受体之间的结合反应等。
第一节 生物素－亲和素免疫细胞化学技术
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin method ）：
S-P（ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex） 技术 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术 （五）CSA（Catalyzed signal amplification）法
（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
1、原理
以生物素标记抗 体作第一抗体，抗生 物素作为第二抗体， 桥接酶标生物素。
2、操作步骤
（1）①-③ 步骤与ABC法操作相同； （2） 加一抗4℃过夜或37℃ 1h； （3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体 37℃ 30min； （4） PBS洗后加亲和素 37℃ 孵育30min；
第一步
第二步
第三步
第四步
第五步
2、操作步骤
（1） 常规脱蜡至水， 必要时用抗原修复处理；
（2） 3% H2Ｏ2甲醇液15min； （3） 正常封闭血清，室温20min，甩干； （4） 滴加特异性一抗4℃过夜或37℃ 孵育1h； （5） PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃ 30min；
（6） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min；
一、基本原理
（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素 （Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力 ； （二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过 氧化物酶等相结合的能力 。
二、几种经典的抗生物素－生物素染色法
（一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术 （二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术
（二）标记生物素-抗生物素技术
（Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术）
1、基本原理
以生物素标 记抗体作第一抗 体，酶标记抗生 物素作为第二抗 体，同S-P技术
LAB法示意图
2、操作步骤
（1）①-④ 步骤与ABC法相同 ； （5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗后加酶标亲和素 （如HRP-Avidin） 37℃ 30min： （7）以下步骤同ABC法。
（5） PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃ 30min；
（6） PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色； （7） 常规脱水、透明、中性树胶封固。
（五） CSA（Catalyzed signal amplification）法
1、原理
根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物 素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大 ， 敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。