如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡

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(1)直接方法:通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力

1、胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法

胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基,也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。

2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

3、Brdu检测法

Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义

4、增殖标志检测

有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如,在人体细胞中,Ki-67抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期和M期表达,而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括,增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。

(2)间接方法:通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力

1、MTT检测法

MTT检测法主要反映细胞的能量代谢,是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法,其原理是在活细胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的甲(Formazan),生成的甲量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。

2、ATP检测

细胞内的ATP含量受到了严格调控,检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ATP浓度成正比,用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。

二、检测细胞分化的方法

1、流式鉴定细胞表面标志,以判断细胞是否分化

2、观察细胞形态,与已分化的细胞进行对比

3、分化诱导评估其分化能力

(1)形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜

染色细胞:凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

常用染色方法:①苏木精=伊红染色

②甲基绿-派诺宁染色:与坏死相比,细胞凋亡的细胞内常有RNA表达的增强,用甲基绿特异性染色DNA,派诺宁对RNA亲和力强,若胞质呈派诺宁阳性为凋亡,阴性为坏死。(前提是已经判断细胞处于死亡形态,通过形态学判断)

③吖啶橙染色法:。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别,可发出不同颜色的荧光,与DNA结合量少发绿色荧光,与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性,能透过细胞膜,使核DNA和RNA染色。因此,在荧光显微镜下观察,吖啶橙可透过正常细胞膜,使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光;在凋亡细胞中,因染色质固缩或断裂为大小不等的片断,形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光,或黄绿色碎片颗粒;而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染液有毒,操作时要戴手套,需避光。

(凋亡小体)

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为 ~1mg/ml。

结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(如图)。

3、透射电子显微镜观察

凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(如图);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

(2)检测凋亡标记物质

1、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。