分子系统学是近30 年发展起来的一门综合性前沿学科, 它在分子水平上对生物进行遗传多样性、分类、系统发育和进化等方面的研究, 其研究结果对于保护生物多样性(尤其是遗传多样性) , 揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意义。
分子系统学(molecu lar systemat ics) 是指通过对生物大分子(蛋白质、榜酸等)的结构、功能等的进化研究，来阐明生物各类群(包括已绝灭的生物类群)间的谱系发生关系的一门学科．相对于经典的形态系统分类研究，由于生物大分子本身就是遗传信息的载体，含有庞大的信息量，且趋同效应弱，因而其结论更具可比性和客观性．尤为重要的是，一些缺乏形态性状的生物类群(如微生物和某些低等动、植物)中，它几乎成为探讨其系统演化关系的唯一手段．由于分子系统学的上述特点，自其诞生之日起，就逐渐在各种生物类群的系统发生研究中得到了广泛的应用．总的说来，迄今分子系统学的研究所获得的生物类群间亲缘关系的结果，大多都和经典的形态系统树相吻合．但是，在一些生物进化谱系不明或模糊关键环节上，它得出的结果却往往和形态系统学的推测大相径庭．
1分子系统学的定义及发展简史
分子系统学是通过检测生物大分子包含的遗传信息, 定量描述、分析这些信息在分类、系统发育和进化上的意义, 从而在分子水平上解释生物的多样性、系统发育及进化规律的一门学科。它以分子生物学、系统学、遗传学、分类学和进化论为理论基础, 以分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段, 是一门交叉性很强的学科。分子系统学使得系统发育和进化的研究进入到在分子水平上对演化机制的本质进行探讨的阶段, 其发展历史根据研究方法的发展大致可分为三个阶段。
20 世纪50～60 年代, 分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行。50 年代以免疫学方法为主, 并在脊椎动物亲缘关系的研究上取了一定成果。1955 年Smithies 发明了淀粉凝胶电泳技术。60 年代中期Hubby 等应用同功酶电泳证明了动物自然群体中存在着大量的遗传变异, 等位酶、同功酶电泳技术开始成为分子系统学的热点技术。
70 年代, 分子系统学研究进入了核酸水平时期。70 年代末期,m tDNA 的限制性片段长度多态性技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用, 到了80 年代末期m tDNA 开始日益成为动物分子系统学研究的有力工具。
80 年代以来, 以多聚酶链式反应( PCR ) 和Sou thern 杂交为基础发展了一系列衍生技术, 如随机扩增多态性DNA 技术、DNA 指纹图谱技术和扩增片段长度多态性技术等, 近几年来又发展了微卫星DNA 指纹图谱技术及核酸序列测定技术, 分子系统学在DNA 水平的研究飞速发展并取得了大量的显著性成果。
22分子系统学的研究方法及应用情况
2. 1蛋白质水平的标记与检测手段
2.1.1同功酶和等位酶电泳
酶电泳始于50 年代, 通过分析酶的电泳谱带可以间接达到在基因水平上研究遗传变异的目的, 同功酶和等位酶是应用最多的两类酶。由于等位酶谱带与等位基因之间关系更加明确, 因而以等位酶电泳的应用更为广泛。可用于酶检测的电泳主要有淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素膜电泳等, 不同的电泳方法或同一方法中不同条件的组合, 对同一样品的分离效果也是不同的, 多数研究表明, 改变电泳条件能检测出更多的变异。
酶电泳方法可以在相对短的时间内检测出大量样本中许多座位上的遗传变异, 在种群水上检测遗传变异快速有效, 方便节省。但它的缺点是可利用的遗传位点数量较小, 只能检测编码酶蛋白的基因位点, 对非编码基因的变异则无能为力; 同时, 密码子同义突变的广泛存在使之无法检测全部的DNA变异, 因而低估遗传变异水平, 而且等位基因位点易受选择压力的影响[, 进一步降低了它用于估计遗传变异的精确性, 因而用等位酶数据实现系统发育重
建说服力较弱。
在采用酶蛋白电泳方法时, 检测尽可能多的位点和样本, 以提高数据的可信度。迄今为止, 酶电泳在分子系统学中的应用已积累了丰富的资料, 如在种内遗传多样性分析、系统发育重建、遗传变异与地理分布关系研究[方面都取得了有意义的成果。由于酶极易失活, 不易运输, 有活性的酶只能从活体动物获得, 因此, 酶电泳方法的应用有一定的限制, 无法应用于濒危动物、古生物和生物标本。
2. 1. 2蛋白质立体结构测定
近年来测定蛋白质的立体结构成为获得分子系统学信息的新技术。由于蛋白质高级结构的进化比一级结构要保守, 因此根据高级结构建立的系统发育关系更加可靠, 但高级结构的研究必须在一级结构清楚的情况下进行, 纯结晶蛋白样品获得的程序复杂, 序列分析仪器精密昂贵, 非一般生化或分子生物学实验室所能完成。然而生物大分子序列和空间立体结构最能准确反应系统演化关系, 随着技术的不断进步, 蛋白质立体结构分析在分子系统学上必将得到广泛的应用。
2. 2DNA 水平的标记与检测
2. 2. 1分子标记技术(间接方法)
①限制性内切酶片段长度多态性技术(rest ric2t ion f ragmen t length po lymo rph ism , RFL P)。
RFL P是80 年代中期发展起来的一种DNA 多态分析技术, 它将目标D NA 序列经一定数目和种类的限制性内切酶(RE) 进行酶切, 由于不同的目标DNA 的序列结构(遗传信息) 有差异, RE在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变, 因而产生相当多的大小不等的DNA片段。然后通过Southern 杂交可以把与被标记DNA 相关的片段检测出来, 从而构建出多态性图谱, 进行系统进化和亲缘关系的分析。
RFL P 分析数据多态信息量大, 结果稳定可靠。重复性好, 不受环境及物种发育阶段影响, 呈孟德尔遗传, 可以有效区分纯合子和杂合子, 而且非等位的RFL P 标记不存在上位效应, 只要有探针就可检测出不同物种或个体的同源DNA 分子的RFL P, 对于物种间亲缘关系的研究特别有用。但RFL P 技术对样品纯度要求较高, 不宜为一般的实验室所采用。另外, 它无法检测靶序列中的重复序列区, 态性检测水平过分依赖于所选用的RE 的种类和数目, 由于不同的RE 识别位点的进化速率不同[ , 因而, 对于不同的进化靶序列, 如果选样不当就会导致分析结果出现偏差。
②微卫星DNA 指纹图谱技术。微卫星DNA 也称简单串联重复序列( simp le sequence repeat,SSR ) , 在所有真核生物基因组中随机分布, 由于重复次数和程度的不同使所在的基因座位呈现一定的多态性。微卫星DNA 的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用, 因而, 被认为是遗传信息含量最高的遗传标记, 并日益成为基因组分析和分子进化最普遍的工具。在分子系统学研究中, 可以利用某个微卫星DNA 两端的保守序列设计一对特异引物, 通过PCR 扩增这个位点的微卫星序列, 然后用探针[ 如(GA GA ) 4 等寡核苷探针]杂交检测微卫星DNA 的变异。微卫星DNA 在基因组中多态性高, 并且等位基因数目多, 呈等显性遗传, 其指纹图谱有极高的多态性, 结果稳定可靠, 重复性好, 适用于任何真核生物的系统进化研究。但是, 微卫星座位突变几率高,对变异反应极其灵敏, 所以易受到趋同变异引起的平行演化(homop lasy) 程度( size) 的影响, 从而给物种间亲缘关系的评估带来误差; 此外, 这一技术耗时较长, 花费较大, 并存在着放射性安全的问题, 而且只能检测那些已知序列的微卫星DNA。由于微卫星DNA 具有许多等价基因并且表现高度的杂合性, 在用其对人类、兽类和昆虫进行种群间遗传测量时, 都表现了高度的有效性, 目前用此技术成功地检测了中国主要杂交水稻亲本间的遗传差异。微卫星DNA 多态性在分析物种进化和系统发生、生物种群内遗传变异以及种群间关系等方面均有重要意义。
