石蜡切片和免疫组化 步骤整理

一：步骤

石蜡切片（骨组织）

1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。

2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。

3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。

4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。）

5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。

6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。）

7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。

8：收片子，37℃保存。

HE染色

1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；

95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）

2：染色：苏木精-2-3min

3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h

4：伊红染色-2min

4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟

5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）

6：封片用树胶∶二甲苯=3:1（1∶1，3∶2）{现配现用}，树胶多一些，用铅笔或者其他工具赶气泡。

目前胞浆染不上颜色

免疫组化

1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）

2：抗原修复：245ml蒸馏水+5ml柠檬酸钠。微波炉高火至沸腾后，然后盖住盒子，低火20min，然后冷却至室温。然后蒸馏水清洗一下

3：3% H2O2 作用10min，PBS浸泡5min×2

4、用山羊血清37℃水浴封闭40min

5、加一抗4℃过夜，阴性对照除外不加一抗。

6、PBS 5min×3

7、加二抗，37℃恒温箱40min，然后PBS 5min×3

8：C液室温30min，然后PBS 5min×3

9、去玻片的水，加DAB染色剂（避光），5min

10、放入水中浸泡5min

11、苏木精，10s，之后放入水中稍洗去苏木精染料，反蓝：蒸馏水（滴状）冲洗1h-2h （这里可以用蒸馏水也可以用热水，但是用热水反蓝的时间短）

12：脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟

13：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min

14：封片：同上

注意：①:为了防止气泡产生，盖玻片可以在酒精灯上预热一下（注意时间不要太长，否则盖玻片温度过高会烫坏组织），然后盖玻片沿45º封片，如果这时还有气泡，可以把玻片放在酒精灯上一下子，然后再用镊子轻轻压一下。）

②每次染色的前后都要用水清洗，然后再放到蒸馏水中