四川省科技进步奖科技进步类提名项目公示
一、项目名称：饲用重组角蛋白酶的创制与应用
二、项目简介
我国饲料工业和养殖业每年需要蛋白质饲料原料约8000万吨，但缺口超过4000万吨。而另一方面，每年有超过300万吨高蛋白质含量的羽毛和猪毛等畜禽屠宰加工副产品被丢弃，造成了巨大的资源浪费和环境污染。究其原因主要是羽毛和猪毛中的主要蛋白质为角蛋白，其含有大量二硫键而几乎不能被动物消化利用。角蛋白酶（keratinase）可水解角蛋白中的二硫键，既可促进动物对角蛋白的消化利用，又能生成具有提高免疫、促进氨基酸和矿物质吸收、促进肠道发育等保健功能的小肽，因此具有较大的应用价值。国外对角蛋白酶已有部分研究和产品，但饲用角蛋白酶产品及其配套应用技术在国内外尚属空白。因此，在四川省科技攻关项目“高酶活重组微生物饲料添加剂开发”等项目的支持下，项目组历时8年，投入经费216万元，针对我国当前饲用角蛋白酶研发的空白，利用基因重组技术，构建具有潜在应用价值的高效角蛋白酶基因工程菌株；并定向突变角蛋白酶基因，提高重组蛋白酶的表达水平和热稳定性；探明重组酶的结构、性质和功效；同时，优化角蛋白酶规模化生产工艺参数；研究饲用角蛋白酶在动物生产中的应用效果，建立相关应用技术，为角蛋白酶的工业化生产、废弃角蛋白的循环利用和饲料蛋白资源开发提供新的有效途径。
通过该项目的研究，成功构建了可高水平表达地衣芽孢杆菌kerA的大肠杆菌和毕赤酵母基因工程菌，其中重组菌P. pastoris pPICZαA-kerAwt 表达的重组酶纯度高，与羽毛粉角蛋白亲和性好。利用定点突变技术，通过两种不同的密码子优化策略优化亲本kerA基因，提高了饲用重组角蛋白酶的表达水平；在亲本kerA基因引入两个Cys生成二硫键，提高了饲用重组角蛋白酶的热稳定性。研究并优化筛选了重组菌P. pastori pPICZaA-kerAopti1在规模化条件下的适宜发酵参数，生产了重组饲用角蛋白酶产品，构建了酶活检测方法。建立了饲用角蛋白酶使用技术，节约了优质蛋白质饲料资源，降低了饲料生产成本，为饲用角蛋白酶的畜禽生产上的合理使用提供了科学依据。通过项目的实施，获授权国家发明专利5项，实用新型专利4项；培养了一批高层次人才，在SCI收录刊物上发表了2篇高质量学术论文。项目通过人才培养、学术会议交流、生产销售产品等形式进行成果转化推广，近三年累计为企业新增销售额96742.75万元，新增利润13512.86万元，经济效益显著。同时，饲用角蛋白酶的应用节约了大量的优质蛋白质资源，减少了畜禽的氮排放，取得了良好的生态效益和社会效益。
经同行专家鉴定认为，项目整体研究达到国际先进水平，其中通过分子改造提高重组角蛋白酶表达水平和热稳定性达到国际领先水平。
三、客观评价
1、成果鉴定专家的评价
2016年5月11日，四川省科技厅组织有关专家对“饲用重组角蛋白酶的创制与应用”项目进行了成果鉴定，专家委员会的鉴定认为：该项目研究成果为角蛋白酶的工业化生产、废弃角蛋白酶的资源化利用和饲料蛋白资源开发提供了新的有效途径。项目整体研究达到国际先进水平，其中通过分子改造提高重组角蛋白酶表达水平和热稳定性达到国际领先水平。
2、查新评价
2016年4月，项目组委托四川省科技成果咨询服务中心科分院分中心对成果进行查新，查新点包括：1）、利用定点突变技术，提高了重组角蛋白酶在毕赤酵母中的表达水平和热稳定性；2）、在30L发酵罐条件下优化发酵工艺提高毕赤酵母角蛋白酶基因工程菌的产酶水平；3）、重组角蛋白酶体外水解羽毛粉的效果评价；4）、猪饲粮中添加重组角蛋白酶显著提高了生长猪养分消化率，提高了肠道乳酸杆菌数，减少了大肠杆菌数。经国内外查新得出结论：除本委托项目研究成果外，未查到其他有和本委托项目查新点内容完全相同的文献报道。
3、研究成果的发表和收录
该项目的相关研究内容形成了2篇论文在国际权威SCI收录刊物上发表。研究的成果收录进专著《猪抗病营养理论与实践》、《动物营养与饲料科学研究进展（1986-2016年）》和全国高等农林院校“十二五”规划教材《动物营养与饲料学》。
4、产品检测报告
该项目转化生产的角蛋白酶产品经农业部饲料质量监督检验测试中心（济南）检测，所检参数均符合相关标准要求（检验报告SBP152135、SBP152136）。
四、推广应用情况
该项目实行产、学、研结合，使研究、开发、推广同步进行。以大型养殖企业和饲料企业为骨干开展成果的推广应用，使该技术成果在我国20余家大中型企业得到推广和应用。根据主要应用单位出具的应用证明，项目技术和成果近三年累计为企业新增销售额96742.75万元，新增利润13512.86万元，经济效益显著。
角蛋白酶在养殖业和饲料工业中的应用节约了大量的优质蛋白质饲料资源，减少了畜禽的氮排放，取得了良好的生态效益和社会效益。
五、主要知识产权证明目录（不超过10件）
六、主要完成人情况
七、主要完成单位及创新推广贡献
（1）四川农业大学
作为项目主持单位，负责项目总体设计及组织、实施，贡献如下：构建了具有潜在应用价值的高效角蛋白酶基因工程菌株；并定向了突变角蛋白酶基因，提高了重组蛋白酶的表达水平和热稳定性；探明了重组酶的结构、性质和功效；研究了饲用角蛋白酶在动物生产中的应用效果，建立了相关应用技术，发表了学术论文2篇，获授权国家发明专利2件；组织了成果推广应用、技术人员培训和指导。
（2）济南百斯杰生物工程有限公司
作为项目的主要完成单位之一，与项目主持单位在科学研究上有着长期的合作关系，对项目的技术创新和主要贡献如下：参与了高效角蛋白酶基因工程菌株的构建；参与了角蛋白酶基因的定向突变，提高了重组蛋白酶的表达水平和热稳定性；主导了角蛋白酶规模化生产工艺参数的优化；负责了饲用角蛋白产品的产业化生产和成果的示范推广。
（4）雏鹰农牧集团股份有限公司
雏鹰农牧集团股份有限公司是我国饲料生产、养殖和精深加工一条龙的龙头企业，A股上市公司。作为项目的主要完成单位之一，与项目主持单位有着长期的技术合作关系，对项目的技术创新和贡献如下：转化项目主持单位有关饲用蛋白酶的成果，研究其配套应用技术；负责应用推广，提高了生猪养殖生产成绩，减少了优质蛋白质饲料原料的使用和氮的排放量。
八、完成人合作关系说明
项目主持人虞洁自2008年启动饲用重组角蛋白酶研究工作以来，就研究内容、资源整合共享、成果转化应用、产品升级换代、人员培训、市场服务等与项目完成人商量研讨数十次，为项目研发和成果转化的顺利实施发挥了组织和推动作用。项目完成人合作关系情况说明如下：
项目完成人何军、王慧芬和黄志清与项目主持人虞洁属于同一课题组，长期共同开展工作，自2008年起参与饲用重组角蛋白酶的研究和成果推广工作。何军是发明专利“一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法”的发明人；何军、虞洁、黄志清合作设计、开展、总结本项目的相关研究结果，合著SCI收录论文2篇，专著和教材各1部。
2012年起，济南百斯杰生物工程有限公司与四川农业大学动物营养研究所开始合作，转化本项目成果，生产和推广饲用重组角蛋白酶系列产品。完成人郭芳坤作为济南百斯杰生物工程有限公司负责人，宋迪作为济南百斯杰生物工程有限公司技术负责人，二人共同负责了饲用角蛋白产品的产业化生产和企业标准的制定以及成果的示范推广，获得授权发明专利3项，实用新型专利4项；近三年来角蛋白酶产品的销售和推广直接为企业新增销售额1481.8万元，新增利润144.8万元。
完成人侯建业是雏鹰农牧集团股份有限公司饲料生产中心负责人，陈金永雏鹰农牧集团股份有限公司饲料生产中心技术总监。自2012年起开始参与项目的推广工作，研究了饲用角蛋白酶产品的配套应用技术；负责饲用角蛋白酶产品和技术的应用推广。近三年来成果推广应用为企业新增销售额5.1亿元，新增利润8223.67万元。
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