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淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。
2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。
3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。
4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。
5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。
6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。
7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。
2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。
4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。
5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。
2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。
2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水）RPMI1640粉末实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜操作流程：1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝3. 稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀）4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2）5. 放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）6. 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。
7. 重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。
8. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度.10. 取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数────────── × 10４×2(稀释倍数)411. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。
注意事项:1. 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释3. 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果4. 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面5. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染淋巴细胞计数：实验流程：1. 准备计数板：2. 制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3. 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4. 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数5. 计算：将结果代入下式，得出细胞密度胞数/毫升原=（4大格细胞数之和/4）×104注意事项：1. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液2. 加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3. 细胞压中线时，数上不数下，数左不数右4. 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5. 镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数。
淋巴细胞分离计数实验报告一、实验目的本实验旨在通过淋巴细胞分离计数实验，了解淋巴细胞的分离过程和计数方法，并掌握相关技能。
二、实验原理1. 淋巴细胞的分离：通过梯度离心法将淋巴细胞与其他血液成分进行分离。
2. 细胞计数：使用显微镜和特殊计数板对淋巴细胞进行计数。
三、实验材料和设备1. 血液样品2. Ficoll-Paque液（用于梯度离心）3. 生理盐水4. 无菌注射器、针头5. 显微镜、计数板四、实验步骤1. 取适量血液样品加入无菌注射器中。
2. 将Ficoll-Paque液加入另一无菌注射器中。
3. 在针头上滴上生理盐水，避免空气进入。
4. 缓慢注入Ficoll-Paque液至血液样品上方。
注意不要将两种液体混合。
5. 离心20分钟，速度为400g。
此时，白色细胞会沉积到Ficoll-Paque层，红细胞会沉积到底部。
6. 用无菌注射器吸取上层白色细胞，转移到新的离心管中。
7. 加入适量生理盐水，混合均匀。
8. 离心10分钟，速度为200g。
此时，淋巴细胞会沉积到底部。
9. 弃去上层液体，用生理盐水洗涤淋巴细胞。
10. 在计数板上吸取适量淋巴细胞进行计数。
五、实验结果分析1. 淋巴细胞的分离效果：根据显微镜下观察到的细胞形态和数量来判断分离效果是否良好。
2. 细胞计数：根据计数板上的规则进行计数，并结合显微镜下观察到的图像来确定结果。
六、实验注意事项1. 操作过程要严格无菌，避免污染样品。
2. 离心过程中要注意速度和时间，以避免对样品产生影响。
3. 计数板要保持干燥和清洁。
七、实验结论通过本次淋巴细胞分离计数实验，我们成功地将淋巴细胞与其他血液成分进行了分离，并通过计数板对淋巴细胞进行了计数。
这些实验结果为我们进一步了解淋巴细胞的生物学特性和相关疾病提供了基础数据。
1.试剂PBS，1640细胞培养液，淋巴细胞分离液； IL-2 ；OK T3，胎牛血清耗材已灭菌的枪头（大、中、小），75%酒精棉球，细胞培养瓶，胶头滴管，滴管，离心管，Ep管，封口膜，酒精灯，镊子，剪刀，记号笔，离心管架2外周单核淋巴细胞的分离与培养取健康人外周血（白膜），Ficoll-hapaque密度梯度离心法分离健康供血者PBMC。
具体方法如下：1)取正常人白膜30ml + PBS缓冲液 270ml（生理盐水），按1：10的比例稀释并混匀；2)在50ml 离心管加入15ml溶积的淋巴细胞分离液，将外周血与PBS缓冲液混合液25ml沿管壁轻缓加入离心管中；3)盖上离心管盖，封口膜封口，1800转/min，离心15min ；4)离心后液面分四层，从上至下分别为PBS缓冲液与血清，淋巴细胞，淋巴细胞分离液，红细胞；5)用胶头滴管吸走大部分的血清与缓冲液层的液体，用胶头滴管小心吸取淋巴细胞层，收集的淋巴细胞置于另一个新的50ml 离心管中；6)加入PBS至45ML刻度处，混匀，1200转/min，10min，弃上清；7)加入30ml PBS，混匀，1200转/min，10min，弃上清，再重悬；8)细胞计数，用1640培养基将淋巴细胞数调至107个/ml，待共培养作准备；单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数──────────×10４×n(稀释倍数)4 PBMC与肿瘤细胞共孵育1腺病毒介导特异性TCR Vβ7.1基因转染PBMC转染1）将刚分离得到的PBMC调节浓度为1×107cell/ml在10%血清的1640培养液中。
2）在6孔板各孔中加入100μl（1×106 cell）以上PBMC溶液。
3）以上6孔板中，每孔加入2.0 ML Ad TCR Vβ7.1 病毒液，加入终浓度为600 IU/ml的IL-2，10ng/ ml的 OK-T3。
