第二章 常用实验技术及方法
一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)
反应总体积为50 µl ，其中含有：
模板DNA 0.5 µl
PCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl
10×MgCl 2 溶液 5 µl
dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl
引物1 (50 umol/L) 0.5 µl
引物2 (50 umol/L) 0.5 µl
Taq DNA 聚合酶 0.5 µl
无菌去离子水加至 50 µl
上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min
94 ℃变性1 min
56 ℃退火1 min
72 ℃延伸2 min
共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR 技术的定点突变
1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下
游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；
2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和
DNA
片段2；
3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl：
片段1 1 µl
片段2 1 µl
10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl
10×MgCl2溶液 5 µl
dNTP (2.5 mmol/L) 5 µl
Taq酶 1 µl
加ddH2O至50 µl
在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；
4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突
变的正确性。
三、Total RNA的提取(Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11)
1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox-14TM
溶液，然后充分混匀；
2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心：
细胞数<5×105 ：9500 rpm (约5 000×g) 5 min
细胞数5×105 - 1×107：3000 rpm (约450×g) 5 min
细胞数>1×107 ：1500 rpm (约112.5×g) 5 min
3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后，12000
rpm离心2 min；
4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；
5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液；
6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液；
7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次；
8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。
四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit)
1. 按Takara Kit中所提供的标准步骤配制PCR 体系；
2. 按以下条件进行RT-PCR反应
(1) 50 ℃ 30 min
(2) 94 ℃ 2 min
(3) 94 ℃ 1 min
(4) 56 ℃ 1 min
(5) 72 ℃ 2 min
3. 重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环；
4. 反应结束后，取3-5 µl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。
五、DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳
50×TAE: 242 g Tris 碱
57.1 ml 冰乙酸
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
1. 称取0.5 g agarose，置于250 ml 锥形瓶中，加入50 ml 1×TAE（含EB 0.5
ug/ml），加热使其全部溶解；
2. 封口、安放梳子；
3. 待凝胶稍凉后铺板；
4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1×TAE，淹没胶面，拔去梳子；
5. 将DNA 样品与6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中；
6. 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下
观察或拍照。
六、从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段（Vitagene DNA 片段回收Kit）
1. 用一灭菌刀片割下含目的DNA 片段的琼脂糖凝胶块，放入Eppendorf管中；
2. 用Vitagene DNA 片段回收Kit，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA
片段。
七、DNA 片段的连接反应
1. 总体系为10-20 µl，外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合；
2. 加入1-2 ul 10×Buffer，2 ul T4DNA连接酶，混匀；
3. 12-16 ℃反应过夜。
八、大肠杆菌感受态细胞的制备
1. 挑取单菌落接种于3-5 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜；
2. 取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养约3 h至对
数生长期(OD600 = 0.4-0.6)；
3. 将细菌转移至50 ml 离心管中，冰浴20 min；
4. 于4℃，4200 rpm 离心10 min，弃上清；
5. 用5 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体，冰浴30 min；
6. 于4 ℃，4200 rpm 离心10 min，弃上清；
7. 用3 ml 0.1 M CaCl2/15%甘油悬浮菌体（动作要轻），每管分装100 µl，立
即使用或置于-70 ℃冰箱保存。
九、大肠杆菌感受态细胞的转化
1. 感受态细胞若保存于-70 ℃冰箱，取出后先在冰上复苏5-10 min；
2. 加入适量DNA 样品，混匀，冰浴30 min；
3. 42 ℃水浴1 min，立即放入冰上冷却2 min；
4. 加入0.5 ml LB 液体培养基，37 ℃振荡培养45 min；
5. 取适量转化的菌体，涂布于含抗生素的LB 平板上，等平板表面的液体被吸
收后，倒置放入37 ℃温箱，培养过夜。
十、大肠杆菌质粒DNA 的小规模制备
(一)、材料：
1. Solution I 葡萄糖50 mM
Tris-HCl (pH8.0) 25 mM
EDTA (pH8.0) 10 mM
2. Solution II NaOH 0.2 M
