实验5 氨基酸纸层析
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氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告引言:氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元,对于研究生物化学和生物学具有重要意义。
而氨基酸的分离鉴定是了解其性质和结构的关键步骤之一。
本实验旨在通过纸层析法对混合氨基酸溶液进行分离和鉴定,以探究纸层析法在氨基酸分析中的应用。
实验步骤:1. 实验前准备:准备好混合氨基酸溶液、纸层析纸、色谱槽和色谱溶液。
2. 制备纸层析纸:将纸层析纸剪成适当大小的长方形,用铅笔在距离底部1.5cm处画一条水平线,再在该线上距离左边1cm处画一个小点。
3. 装置纸层析槽:将纸层析纸的底端浸入色谱槽中,确保纸层析纸上方的溶液不超过纸层析纸的底端。
4. 样品加载:用微量吸管将混合氨基酸溶液滴在纸层析纸上的小点上,尽量避免溶液滴到纸层析纸以下的溶液中。
5. 开始分离:将色谱槽盖好,待溶液上升至纸层析纸的顶端时,取出纸层析纸,迅速标记各个斑点的位置。
6. 斑点分析:将纸层析纸放入紫外灯下观察,记录各个斑点的颜色和位置。
结果与讨论:通过纸层析法,我们成功地将混合氨基酸溶液进行了分离和鉴定。
在紫外灯下观察,我们可以清晰地看到在纸层析纸上出现了多个斑点。
根据斑点的颜色和位置,我们可以初步判断其中的化合物。
在本次实验中,我们使用的混合氨基酸溶液包含了苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸三种氨基酸。
根据实验结果,我们可以看到在纸层析纸上出现了三个主要的斑点。
根据颜色和位置的初步判断,我们可以推测第一个斑点为苏氨酸,第二个斑点为甘氨酸,第三个斑点为丙氨酸。
然而,仅凭颜色和位置的初步判断还不足以确定化合物的身份。
为了进一步确认各个斑点的化合物,我们可以利用已知标准物质进行对照。
通过比较已知标准物质的斑点与实验样品的斑点,我们可以准确地鉴定各个斑点所代表的氨基酸。
结论:通过纸层析法,我们成功地对混合氨基酸溶液进行了分离和鉴定。
根据初步判断,我们可以推测出混合溶液中的苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸的存在。
氨基酸的纸层析法实验报告1. 引言嘿,朋友们,今天咱们来聊聊氨基酸的纸层析法。
这可不是一杯简单的饮料,而是一个神奇的科学实验,听起来很高大上,但其实也没那么复杂。
氨基酸嘛,就是咱们身体里蛋白质的小砖块,没了它们,咱们就像没有基础的房子,摇摇欲坠。
通过纸层析法,我们可以把这些小家伙分开,看看它们到底有多丰富多彩。
准备好了吗?让我们一起开启这段有趣的科学之旅吧!2. 实验材料与方法2.1 材料准备首先,咱们得准备一些实验材料。
这可不能马虎。
需要的东西有:氨基酸标准品,纸层析纸,移动相(比如水和乙醇的混合液),还有一根小刷子,嘿,别问我为啥,刷子可不是用来洗碗的哦!还有,一些试管和显色剂,听上去是不是有点像魔法工具?其实,科学就是这样的,越简单越好,咱们不需要搞得像厨房做大菜那么复杂。
2.2 实验步骤接下来,咱们就进入到实验步骤了。
首先,取一小块纸层析纸,在上面标记好氨基酸的起始点。
然后,取一点氨基酸溶液,用刷子沾取,轻轻一抹,别太用力,不然纸层析纸可受不了哦。
接着,把纸条放进盛有移动相的容器里,嘿,这时候你可以等着看好戏了。
移动相会慢慢爬上纸条,把氨基酸分开,像魔术一样!你可得耐心等,别心急,科学可不是速食面,得慢慢来。
3. 实验观察与结果分析3.1 观察结果时间一到,你会看到纸条上出现了一道道五颜六色的条纹,就像调色板上的颜料一样,哇,这个时候真的是太激动了!每种颜色代表着一种氨基酸,它们就像在纸上跳舞,简直让人看得目不暇接。
不同的氨基酸会有不同的移动速度,有的懒洋洋的,有的则飞快跑了。
这就是化学世界的魅力所在,真是让人惊叹不已!3.2 数据分析不过,光看颜色可不够,咱们还得做点数据分析。
通过测量每种氨基酸的迁移距离,咱们可以计算出它们的Rf值。
Rf值就像是氨基酸的身份证,能告诉我们它们的特性。
这时候,可能会有人问:“这些数据有啥用啊?”别急,科研可不是一蹴而就的,咱们通过这些数据,可以进一步研究氨基酸的结构和功能,这可是生物化学的基础呢。
氨基酸纸层析实验报告
目录
1. 概述
1.1 氨基酸层析原理
1.1.1 纸层析技术
1.1.2 氨基酸分离原理
1.2 实验材料和仪器
1.3 实验步骤
1.4 结果与分析
1.5 实验应用和意义
概述
在本实验中,我们将探讨氨基酸纸层析实验,通过这项实验来了解氨
基酸的分离原理以及纸层析技术的应用。
氨基酸层析原理
纸层析技术
纸层析技术是一种常用于分离物质混合物的方法,基于不同物质在纸
上移动的速度不同而实现分离的原理。
氨基酸分离原理
氨基酸具有不同的疏水性和亲水性,因此在纸层析过程中会根据它们
与试剂液之间的相亲和力不同而移动的速度有所不同,从而实现分离。
实验材料和仪器
本次实验所需材料包括:氨基酸样品、纸层析试纸、显色剂等。
实验
所用仪器主要有吸管、显微镜等。
实验步骤
1. 在纸层析试纸上加载混合的氨基酸样品。
2. 将试纸放入显色剂中进行显色反应。
3. 观察试纸上氨基酸斑点的分离情况。
结果与分析
根据实验结果可以得出各个氨基酸在纸层析试纸上的分离情况,进而分析其性质和相互作用。
实验应用和意义
氨基酸纸层析实验在生物化学和医学领域有着重要的应用价值,可以帮助科研人员了解氨基酸之间的关系和性质,为后续的实验研究提供参考依据。
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告嘿,大家好!今天咱们聊聊一个特别有趣的实验,那就是氨基酸的分离鉴定纸层析法。
听起来高大上吧?别急,咱们一步一步来,轻松愉快地聊聊这玩意儿。
什么是氨基酸呢?简单来说,氨基酸就像是构成蛋白质的小积木,是咱们身体里不可或缺的营养成分。
它们在咱们的饮食中扮演着超级重要的角色,没了它们,咱们可真是没法“搭建”身体啦。
那这个实验就是要从一堆混合的氨基酸中,把它们一个个分开来,看看每种氨基酸都长啥样。
这就好比一群朋友在聚会上,咱们要找出每一个人的名字和特点。
纸层析法,乍一听是不是觉得有点复杂?它就像一场化学界的“寻宝游戏”。
我们准备一些特殊的纸,涂上一层薄薄的吸附剂,然后把混合好的氨基酸样品放在纸上,接着让溶剂在纸上慢慢爬。
这就像在纸上画一幅画,溶剂就像水彩笔,慢慢把氨基酸分开。
哎呀,那个过程可是精彩极了,等溶剂跑到纸的顶端,咱们就能看到不同的颜色带,像极了彩虹,五颜六色的,真让人眼前一亮。
在实验开始之前,咱们得先准备一些材料。
准备好氨基酸混合物、溶剂、吸附剂,当然还有那张神奇的层析纸。
哎呀,别忘了安全第一哦,实验室里的化学品可得小心翼翼。
准备好一切后,咱们就可以开始“探险”了。
把样品点在纸上,别点得太多,得掌握好量,太多可就闹笑话。
点好后,咱们把纸条放进装有溶剂的容器里,让它们开始亲密接触。
此时,你就得耐心等待,静静看着溶剂爬升。
这个过程有点像看电影,心里总有些小期待,究竟哪种氨基酸会最先出来,哪个又会拖拖拉拉。
等到溶剂爬到纸的顶端,咱们小心翼翼地把纸拿出来,哇,简直像一幅美丽的艺术作品!不同的氨基酸形成了不同的斑点,有些淡淡的,有些鲜艳的,就像小精灵在纸上跳舞。
咱们得计算一下每种氨基酸的Rf值,这个值可以帮助咱们确定它们的身份。
Rf值计算起来其实也不复杂,记住,Rf值就是迁移距离除以溶剂前沿的距离。
简单吧?计算的时候得集中精神,别让自己的小脑袋跑偏了。
在整个过程中,最有趣的莫过于跟同学们讨论结果了。
氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法(paper chromatography of amino acids)是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容,以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。
一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。
其原理是在一根滤纸条上画上水平的线,将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上,待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进,不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同,从而实现氨基酸的分离和测定。
二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备(1)准备氨基酸样品,将其溶解在适当的溶剂中,并使用pH 计调节至适当的酸碱度。
(2)准备滤纸条,按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。
(3)准备层析槽,将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代,避免有光照射到。
2. 进行层析实验(1)在滤纸条上绘制水平基线,并将标记的点分开,便于后续氨基酸的测定。
(2)将氨基酸溶液直接点于滤纸条上,点的位置要尽量靠近基线,以避免扩散的影响。
(3)将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中,保持溶剂的面平稳。
(4)待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透,不同氨基酸迁移的距离不同,最终在纸条上形成清晰的色斑。
(5)将纸条取出,用热风干燥,然后在紫外灯下进行观察和记录。
3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来,并测量它们与基线之间的距离。
然后,根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度,并与标准曲线进行比较,从而得出待测氨基酸的浓度。
三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等,需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。
2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸,需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。
3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行,避免光照和温度过高。
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告一、实验目的1、掌握纸层析法分离和鉴定氨基酸的基本原理和操作方法。
2、学习如何根据氨基酸在层析纸上的迁移率(Rf 值)来鉴定氨基酸。
二、实验原理纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
滤纸纤维上的羟基具有亲水性,能吸附一层水作为固定相,而有机溶剂作为流动相。
当有机相沿滤纸经过样品点时,样品点中的溶质在水和有机相之间进行分配。
由于不同的氨基酸在两相中的分配系数不同,导致它们在滤纸上的迁移率不同,从而实现分离和鉴定。
Rf 值(比移值)是氨基酸在层析中的特征值,计算公式为:Rf =溶质移动的距离/溶剂移动的距离。
三、实验材料与仪器1、实验材料标准氨基酸溶液:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸。
混合氨基酸溶液。
展开剂:正丁醇:冰醋酸:水= 4:1:5(体积比)。
显色剂:025%茚三酮溶液。
2、实验仪器层析缸。
毛细管。
喷雾器。
烘箱。
直尺。
四、实验步骤1、准备滤纸选用一张大小合适的滤纸,在距底边 2cm 处用铅笔轻轻画一条横线,作为起始线。
2、点样用毛细管分别吸取标准氨基酸溶液和混合氨基酸溶液,在起始线上轻轻点样,每个点的直径不超过 2mm,点样后自然风干。
3、层析将滤纸垂直放入装有展开剂的层析缸中,滤纸下端浸入展开剂约1cm,注意滤纸不要与缸壁接触,盖上盖子,进行层析。
当展开剂前沿上升至距滤纸顶端约 1cm 时,取出滤纸,用铅笔标记展开剂前沿的位置,自然风干。
4、显色用喷雾器将显色剂均匀地喷在滤纸上,放入烘箱中,在 80℃左右烘 5 10 分钟,直至斑点显色清晰。
五、实验结果与分析1、测量并计算 Rf 值用直尺分别测量标准氨基酸和混合氨基酸斑点中心到起始线的距离(a)以及展开剂前沿到起始线的距离(b),计算 Rf 值。
2、结果分析根据计算得到的 Rf 值,对照标准氨基酸的 Rf 值,鉴定混合氨基酸溶液中的成分。
六、注意事项1、点样时要避免毛细管的尖端刺破滤纸,且点样量要适中,过多会导致斑点扩散,影响分离效果。
氨基酸纸层析实验报告氨基酸纸层析实验报告本实验旨在通过氨基酸纸层析技术,分离并鉴定所给混合氨基酸中的各个成分。
实验原理:氨基酸分子具有酸性和碱性两个官能团,分别为羧基与氨基,其pH值和离子强度也对分子运动轨迹产生显著变化。
氨基酸纸层析就是基于这一原理,依靠吸附、电荷、配位等酸碱性质的不同,通过在滤纸中运用缩小缩液法制备分子筛层,从而在一定的溶剂作用下无规运动,完全分开各组分的谱带,从而实现氨基酸的分离和检验。
实验步骤:步骤一滤纸制备1. 在蒸馏水中加入10%(w/v)海藻酸钠,稳定后取出一部分滤纸,将其浸泡在其中。
并让其均匀地浸入溶液中,看待其依次从表面吸收水分。
2. 把浸润的滤纸用毛刷移到桌面上。
如果水在表面不能自由移动,那么抽去滤纸上的多余水分。
然后将滤纸直接放在桌子上晾干。
步骤二混合氨基酸的样品准备1.向分析仪器中按顺序分别加入氨基酸混合液10μl,Pb(Ac)2溶液0.5ml并在机械震荡下均匀搅拌。
2.在这样的过程中,可以看到各个氨基酸组分在溶液中的展开听待,但由于不同氨基酸之间的反应性差异,这种现象只会在一定程度上显现出来。
步骤三:纸层析操作1.将干燥的滤纸放在台盆上。
在其表面滴上2~3滴混合样品。
2.运用蒸馏水浸润纸层。
然后在温室中干燥。
溶质部分因为吸收了纸层中水分而向上移动。
水分按照两个层面运动,它们之间的活动产生了多个谱带,每个谱带都代表着一组溶质。
3.在整个流程中,我们还需要对纸层的某个部分进行显色,比如使用LC中醛试剂,用其混合氨基酸样品可优先在纸层中显示出为碘色的Phe的谱带。
比较这个谱带与所分析的样品,就可以对其成分进行初步鉴定。
实验结果:通过以上实验操作,我们成功地将所给的混合氨基酸分离出来,同时也对不同成分的酸碱性质有了更为深入的了解。
本次实验最大的收获是,学习到了一种新的分析技术,掌握了其操作方法,这对我今后的化学实验研究中将会有很大的帮助。
总结:氨基酸是大分子有机化合物。
氨基酸的纸层析实验报告氨基酸的纸层析实验报告引言:氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元,对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析是一种简单而有效的分离技术,可用于分离和鉴定氨基酸。
本实验旨在通过纸层析技术对氨基酸进行分离和鉴定,进一步了解氨基酸的性质和特点。
实验材料和方法:材料:苯酚、丙酮、氨基酸溶液(酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸)方法:1. 准备纸层析板:在纸层析板的一端绘制一个起点线,距离底部约2 cm。
2. 在起点线上分别滴加不同氨基酸溶液,每个溶液滴加约1 cm。
3. 将纸层析板放入含有苯酚和丙酮的密闭容器中,使其与溶剂接触,但不要浸泡。
4. 等待溶剂前进至纸层析板的顶端,取出纸层析板并迅速标记出溶剂前进的距离。
5. 用紫外灯照射纸层析板,观察各氨基酸的色谱带。
结果与讨论:通过实验,我们成功地进行了氨基酸的纸层析分离和鉴定。
根据实验结果,不同氨基酸在纸层析板上产生了不同的色谱带,表明它们在溶剂中的迁移速度和亲和性不同。
首先,酪氨酸的色谱带位于起点线上方最高位置,表明酪氨酸与溶剂的亲和性最低,迁移速度最慢。
这可能是由于酪氨酸分子结构中的芳香环和羟基团导致了其与溶剂的较弱相互作用。
其次,赖氨酸和谷氨酸的色谱带位于起点线上方,但位置较低。
这表明赖氨酸和谷氨酸与溶剂的亲和性较高,迁移速度较快。
赖氨酸和谷氨酸分子中的带正电荷的氨基团可能与溶剂中的负电荷相互作用,加快了它们的迁移速度。
甘氨酸和丝氨酸的色谱带位于起点线以下,迁移速度最快。
这表明甘氨酸和丝氨酸与溶剂的亲和性最高,迁移速度最快。
甘氨酸和丝氨酸分子中的带负电荷的羧基可能与溶剂中的正电荷相互作用,加快了它们的迁移速度。
总结:通过纸层析实验,我们成功地分离和鉴定了不同氨基酸。
实验结果表明,氨基酸的迁移速度和亲和性与其分子结构密切相关。
进一步研究氨基酸的纸层析技术可以帮助我们更好地了解蛋白质的结构和功能,对于生物化学和生物医学领域的研究具有重要意义。
氨基酸的纸层析实验报告实验目的:掌握氨基酸纸层析技术,通过纸层析分离和定性鉴定氨基酸。
实验原理:氨基酸的纸层析是利用氨基酸对不同的升华剂的选择性吸附而实现分离的一种分析方法。
纸层析方法较简便、快速,并能够同时分离、定量、定性分子。
这使它在生物化学、蛋白质化学、微量分析等领域中得到了广泛应用。
实验过程:1.准备氨基酸标准溶液:取苯丙氨酸、天门冬酰胺酸、色氨酸、赖氨酸、小麦谷氨酸和组氨酸各10毫克,加入10毫升0.02mol/L HCl和1滴10%酚酞指示剂,用水定容至100毫升。
2.制备氨基酸样品:取10毫升氢氧化钠溶液和0.3克氨基酸溶液混合,使其溶解并加热至沸腾,将样品冷却到室温,并加入1毫升0.02mol/L盐酸。
3.准备纸层析板:将富马酸纸(6cm*0.8cm)沿宽度中心折叠,使其成为4cm*0.8cm的大小;将纸上端用20毫升1-丙醇-甲醛-草酸钾(6:0.4:4)振荡2次,再用烘箱烘干,使其完全干燥。
4.纸层析:将样品以细滴的形式滴在纸层析板下端处,将纸放入深度为2-3厘米的玻璃瓶中,瓶底加入1毫升0.2mol/L HCl溶液,并将其密封。
板上的液相在升华过程中被移动,当溶剂距离顶端紫色标记线1厘米时把纸层析取出,用乙醇-水(1:1)固定,并在水龙头下冲洗。
5.涂上氨基酸显色剂:将纸层析用10%磷酸液浸泡5-10分钟,使显色剂透彻纸层析板。
6.观察分析:根据分离的结果和标准溶液进行比较,以鉴定和定量分析被检测的氨基酸。
实验结果:在纸层析板上,分离了7种氨基酸。
在试验中,我们发现沿着纸层析板距离最短的氨基酸为小麦谷氨酸,距离最远的是组氨酸。
结果与标准溶液分析结果相符,可以证明该方法可以用于氨基酸的分离和定性鉴定。
实验结论:该实验使用氨基酸纸层析技术,成功地将氨基酸分离并鉴定。
该方法应用广泛,简便易行,能够分离、定性、定量不同的化合物。
种类繁多、方法不断丰富,成为分析化学领域中重要的分析手段。
氨基酸的纸层析实验报告氨基酸的纸层析实验报告摘要:本次实验旨在通过纸层析法对不同氨基酸溶液进行分离和检测,以研究其迁移率和相对极性的差异。
通过选取适当的溶剂系统和纸层析条件,我们成功地分离了五种常见氨基酸,并确定了它们在纸上的迁移程度。
实验结果表明,纸层析法是一种简单、快速且有效的技术,可用于氨基酸的分离和鉴定。
引言:氨基酸是生物体中构成蛋白质的基本组成单元,对于研究生物体的代谢、结构和功能具有重要意义。
为了快速、准确地分离和检测氨基酸,科学家们发展出了多种分析技术,其中之一就是纸层析法。
纸层析法是一种基于物质在吸附剂(纸)上的迁移差异进行分离的技术,被广泛应用于生物化学和药物研究领域。
本实验旨在通过纸层析法对氨基酸进行分离和鉴定,以深入了解氨基酸的性质和特点。
材料与方法:1. 实验材料:- 氨基酸样品:丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸。
- 层析纸:常规过滤纸。
- 层析溶剂:正丁醇/蒸馏水(7:3)混合液。
2. 实验步骤:1. 准备样品溶液:将每种氨基酸样品分别加入适量的蒸馏水中,制备浓度为0.1 mol/L的氨基酸溶液。
2. 准备层析纸:在纸层析仪中放置一条纸带,细细地描绘线8 cm以上,标明起始点和结束点。
3. 样品加载:使用吸管或微量注射器,将每种氨基酸溶液滴于纸带的起始点上,注意避免溶液的扩散。
4. 层析过程:将纸带放入层析仪中,加入适量的层析溶液至稍高于纸带的底部,待溶液达到上端时取出纸带,立即标记氨基酸的悬浮位置。
5. 结果分析:测量标记点距离起始点的距离,并计算各氨基酸的迁移率。
结果与讨论:在本次实验中,我们成功分离了丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸这五种常见氨基酸。
根据实验结果,我们发现不同氨基酸在纸上的迁移率存在一定差异。
迁移率较大的氨基酸,其在纸上的可见位置相对靠近起始点;而迁移率较小的氨基酸,则迁移较慢,位置较远。
这种差异主要与氨基酸的极性有关。
极性较大的氨基酸更容易与层析纸上的极性团结合,从而减缓其迁移速度;而极性较小的氨基酸则与层析纸上的极性团的作用较弱,迁移速度较快。
实验五氨基酸纸层析法
一、目的
1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理、意义和具体操作。
2、了解不同溶剂体系对样品的分离效果;
3、了解氨基酸的一些理化性质。
二、原理
用滤纸为支持物进行层析的方法,称为纸层析法。
纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成,滤纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时,水是固定相,有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的,称上行法;由上向下移动的,称下行法。
将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展层,样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
出于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来,形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示:
R f=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变,R f值是常数,故可根据R f值作定性依据。
样品中如有多种氨基酸,其中某些氨基酸的R f值相同或相近,此时如只用一种溶剂展层,就不能将它们分开。
为此,当用一种溶剂展层后,将滤纸转动90°,再用另一溶剂展层,从而达到分离的目的,这种方法称为双向纸层析法。
氨基酸无色,利用茚三酮反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
三、实验器材
滤纸(大滤纸,新华双圈滤纸60cm×60cm等)
烧杯,剪刀,层析缸,毛细管,电吹风,培养皿,小订书机等。
四、实验试剂
四种氨基酸:组氨酸,酪氨酸,脯氨酸,精氨酸各1g
正丁醇(A.R.),正丙醇(A.R),95%乙醇,甲酸,0.4mol/L茚三酮-异丙醇
五、操作
1、配制氨基酸溶液:
分别称取组氨酸,酪氨酸,脯氨酸,精氨酸60mg,分别溶解在10mL 0.1mol/L的盐酸溶液中,贴好标签(6mg/ml)。
极性不相似样品:分别称取60mg组氨酸,酪氨酸,脯氨酸,混合溶解在10mL 0.1mol/L的盐酸溶液中。
极性相似样品:分别称取60mg组氨酸、精氨酸,混合溶解在10ml 0.1mol/L的盐酸溶液中。
2、配制两种溶剂系统:
溶剂一:正丙醇-水,体积比为75:25;375mL正丙醇+125mL水;
溶剂二:正丁醇-乙醇-水,体积比为60:20:20;300mL正丁醇+100mL乙醇+100mL水
3、配制显色储备液,配制0.4mol/L茚三酮-异丙醇250mL(称量17.8g水合茚三酮,溶于250mL异丙醇),再按照体积比:V(0.4mol/L茚三酮-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5配制。
4、标难氨基酸单向上行层折法
(1)滤纸准备:将滤纸裁成20cm×25cm的长方形,在距纸一端2cm处划一基线,在
线上每隔2-3cm,画一小点作点样的原点,见图1。
(2)点样:氨基酸点样量以每种氨基酸含5-20μg以为宜,用微量注射器或毛细管吸取氮基酸样品10μl点于原点(分批点完),点子直径不能超过0.5cm,边点样边用电吹风吹干。
(3)展层和显色:将点好样的滤纸,用白线缝好,制成圆筒,原点在下端,浸立在培养皿内,不需平衡,立即展层,展层剂为溶剂一,把展层剂混匀,倒人培养皿内,同时加入显色贮备液(每10ml展层剂加0.1-0.5m1的显色贮备液)进行展层,当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm时取出滤纸,吹干,层析斑点即显蓝紫色。
用铅笔划下层析斑点,可进行定性、定量测定。
图1 单向纸层析示意图图2 双向纸层析点样
5、混合氦基酸双向上行纸层析
(1)滤纸准备:将滤纸裁成20cm×20cm正方形,距滤纸相邻两边各2cm处的交点上,用铅笔轻划一点,作点样用,见图1。
(2)点样:取混合氨基酸溶液(5mg/ml)10-15μl,分次点于原点,如图2。
(3)展层和显色:将点好的滤纸卷成半圆筒纸,用线缝好.竖立在培养皿中(图3),原点应在下端:置少量12%氨水于小烧杯巾,盖好层析缸,平衡过夜。
次日,取出氨水,加适量溶剂一(第一向)于培养皿中,盖好层析缸,上行展层,当溶剂前沿距滤纸上端1-2cm 时,取出滤纸,冷风吹干。
将滤纸转90,再卷成成半圆筒状.竖立于干净培养皿中,并于培养皿中中置少量溶剂二,盖好层析缸,平衡过夜。
次日将加有显色剂的酸相溶剂(每10ml 展层剂加0.1-0.5ml显色贮备液)倾入培养皿,进行第二向展层。
展层毕,取出滤纸,用热风吹干,蓝紫色斑点即显现。
图3 纸层析装置图4 氨基酸双向室温纸层析图谱示意图(1层析纸,2平衡溶液,3培养皿)酸、碱二向层析溶剂系统示意图
(4)定性鉴定与定量测定:双向层析R f值,由两个数值组成,在第一向计量一次,第二向计量一次,分别与已知的氨基酸在溶剂一和二两个系统中的R f值对比,即可初步决定它为何种氨基酸的斑点(图4为使用酸碱二向层析系统的示意图)。
定量方法:将它剪下,在同一张纸剪下一块大小相同的空白纸作对照,用硫酸铜-乙醇溶液(V(0.1%硫酸铜):V (75%乙醇)=2:38,临用前按比列混合)洗脱,用722型分光光度计测定其吸光度,在标准曲线上查出氨基酸含量。