HBV基因分型和耐药突变基因检测的临床应用_图文.ppt

检测限为20%；
所有突变位点 1、测序试剂大 多未获得 SFDA 批
检测限为5%；
仅能检测 rt204位点
灵敏，最低检测限为 5%；
已知耐药位点
我国4种核苷类药物7个
耐药位点的16种突变 1 、是首个获得 SFDA 批
1 、需针对每一个待测 突变位点，分别设计特 异性内切酶反应体系； 2 、一些突变可能生成 新的酶切位点，或破坏 原有酶切位点，必须谨 结果仅提示
抗病毒治疗中的监测(线路图）
治疗第12周评估是否存在“原发性无应答” 病毒学应答： HBV DNA 较基线下降 ≥10IU或≥50拷贝/ml 原发性治疗失败： HBV DNA 较基线下降 ≤ 10IU或≤ 50拷贝/ml 患者依从性良好： 加用更强的抗病药物 治疗24周评估疗效的早期预测因子 完全病毒学应答： PCR检测 HBV DNA 阴性 以同一药物继续治疗， 每6个月监测一次 部分病毒学应答： 60IU/ml≤ HBV DNA ≤2000IU/ml 基因屏障高的药 物：每3个月监 测一次并在48 周后继续监测 不充分病毒学应答： HBV DNA ≥2000IU/ml 抗病毒能力相对 低的药物：每3个 月监测一次并在 48周后继续监测 患者依从性不佳： 督促劝说坚持治疗
基因屏障低的药 物：加用基因变 异特点不同的第 二种药物
加用更强的抗病 毒药物：每3个月 监测一次
Keeffe，et al.Clinical Gastroenterology and Hepatology，2007，5：890—897
若第48周获得完全病毒 学应答，则继续治疗
若第48周未获得病毒学应答，则 加用一种更强且无交叉耐药的药物
病毒药物作用靶区，耐药基因突变热点区
S基因：分型检测

HBV基因与耐药检测临床版
contents
目录
• HBV基因概述 • HBV耐药性检测 • HBV基因与耐药性的关系 • HBV基因与耐药性检测的临床应用 • 未来展望与研究方向
01 HBV基因概述
HBV基因结构
HBV基因由3200个核苷酸组成， 分为四个部分：核心区、X基因、
前C区和C区。
前C区和C区是HBV基因中最重 要的部分，编码HBeAg和
监测
通过定期检测HBV基因和耐药性，可 以监测病毒的变异和耐药性的发展， 及时调整治疗方案。
治疗方案选择
个体化治疗
根据HBV基因型和耐药性检测结果，为 患者制定个体化的治疗方案，提高治疗 效果。
VS
避免耐药性
通过检测耐药性，可以避免使用无效或易 产生耐药性的药物，减少耐药性的发生。
治疗效果评估
病毒载量变化
耐药性产生
HBV基因变异导致病毒对药物的敏感性降低，使得药物治疗效果不 佳，甚至无效。
变异类型
常见的HBV基因变异包括点突变、插入突变和缺失突变等，其中点突 变是最常见的变异类型，也是导致耐药性的主要原因。
耐药性产生的影响
疾病进展
HBV耐药性产生后，病毒复制不受控制，疾病进展加速，肝衰 竭和肝细胞癌等并发症的风险增加。
耐药性基因型与表型关系
研究HBV基因型与表型之间的关系，通过基因型预 测表型耐药性，为临床治疗提供指导。
耐药性传播与进化
研究HBV耐药性在不同地区、不同人群中的 传播和进化规律，为全球范围内的耐药性监 测提供支持。
个体化治疗策略的探索
个体化治疗方案制定
根据患者的基因型、表型及临床特征， 制定个体化的治疗方案，提高治疗效
低，从而产生耐药性。

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HBV基因型与肝脏疾病的预后
•
人类感染HBV基因组的型别可能与感染途径 有一定的相关性。东方国家以母婴传播为主，而 西方国家则以性传播及静脉注射毒品传播为主。 部分学者认为，母婴传播的危险性取决于HBV复 制水平。HBsAg和HBeAg均阳性的母亲有8090%的母婴传播危险性，约有85％的婴儿日后成 为慢性HBV携带者; HBsAg阳性和HBeAg阴性的 母亲仅有2-15%的母婴传播危险性，且后代很少 成为慢性HBV携带者。东亚地区的乙肝病毒携者 带较西方国家多，这可能与东亚地区以B，C型为 优势基因型，其HBV呈高复制水平有9
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• HBV 基因型与临床表现、预后、治疗应答均 有一定关系。
1、不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C 型对肝 的损伤比 B 型严重，基因型 C比基因型 B更容易发 展成为肝硬化 。 2、不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比 基因型 C对干扰素治疗的应答率高。
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• HBV基因分型对慢性肝病的诊断有重要的指导意义， 可根据不同的基因型对疾病发展进行有效预测。
HBV基因分型的临床意义
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• • • • • •
1、 引言 2、 HBV基因型及分型的方法 3、 HBV基因型的地域分布 4、 HBV基因型与致病性 5、 HBV基因型与肝脏疾病预后 6、 HBV基因型与抗病毒疗效的关系
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引言 • 通过长期的临床观察，发现同一种抗病毒药物用
于不同乙肝患者时，治疗效果不同，且同一患者
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• 3、HBV基因型的种类：根据HBV全基因核 苷酸序列异源性≥8％或者S基因区核苷酸序 列异源性≥４％的原则，目前分为8个基因 型即A，B，C，D，E，F，G和H型。

肝脏组织学损伤。
• 当变异株最终推翻了野生株的统治成功当家作主后，耐药发展到了 “临床耐药”阶段。这时候，乙肝病人血液中的HBV DNA水平会反 弹升至1×106拷贝/毫升以上，最终出现肝功能异常、肝脏组织学损 伤。
• 因此，我们在“病毒学耐药”阶段及“基因耐药”阶段就应该尽早进 行干预，及时阻止“病毒学耐药”朝“临床耐药”的恶性方向发展。
基因测序法的准确度与可靠性是其他 方法不可替代的，它是基因耐药检测的 “金标准”。乙肝病毒耐药基因测序结果 能精确指导用药，确保抗病毒治疗取得最 佳疗效。
一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变 异），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和ALT反弹
HBV阿德福韦耐药
• 阿德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物， 可明显抑制HBV DNA复制
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1%
• HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
cycles →4℃恒温。
60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR 最大差别，目的是为了扩增出一系列相差 一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。
测序反应得到的产物经过酒精纯化， 甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电 泳。
酒精纯化的目的是去除未结合的荧光 染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。 此步对测序成功非常关键，关系到测序峰 图质量的好坏。
rtL180M
rtM204V/I/ S
rtV214A rtQ215S rtN236T
rtS202G/I rtM204V/I rtM204V/I/S /S
rtM250L/V
rtV207I/L/G rtP237H

HBV基因型与抗病毒药物疗效
HBV不同的基因型在针对慢性乙Biblioteka 肝炎患者的抗病毒 治疗疗效上存在差异。
A基因型对干扰素治疗的应答率高于D基因型，B基因 型高于C基因型；A和D基因型又高于B和C基因型。
基因型是否影响核苷类似物的疗效尚未确定。
HBeAg(+)慢性乙肝患者的疗效差异(一)
IFN反应性
另外，BCP变异是肝癌发生的独立危险因素之一。
C1(Cs)
东亚：中国大陆、台湾、日本、韩国
C2(Ce)
中国大陆、香港、马来西亚、泰国、孟加拉国
C3
玻利尼西亚
C4
澳大利亚东北部
HBV基因型的国内地理分布
我国的HBV基因型有：A型、B型、C型和D型。 北方城市以基因C型流行为主，由北方至南方，基因
HBV基因型的检测方法
全基因或S基因序列测定； 基因型特异性引物PCR法； 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法
(PCR-RFLP)； 线形探针反向杂交法(INNO-LiPA)； PCR微量板核酸杂交酶联免疫法。
HBV基因型检测的应用价值
预后判断； 抗病毒治疗方案选择； 辅助耐药突变基因检测。
HBV基因型的基本概念
根据HBV全基因核苷酸序列异源性≥8%或者 S基因区核苷酸序列异源性≥4%，将不同病 毒株分为不同的基因型。
迄今为止，HBV可以分为8个基因型，即A、 B、C、D、E、F、G和H型。
HBV基因型的地理分布
HBV基因型的全球地理分布 HBV基因型的国内地理分布
HBV基因型的全球地理分布(一)
与B型相比，C型呈北-南递减分布：C型主要分布于中国的北方 省份，而B型主要分布于南方省份。
HBV基因型与病毒标志物的清除

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•抗-HBe：
•意味着 HBV部分被清除或抑制，复制减少， 传染性降低, 但慢性肝炎, 肝硬化阳性率高
• e抗体和e抗原一般不同时存在，e抗原消失， e抗体产生。
• e抗体（+）说明患者曾出现过HBeAg
• 但对e抗体（+）者不可视为HBV复制平息。
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抗-HBc IgM ： 是诊断急性乙型肝炎和判断 病毒复制活跃的指标，并提示病人血液有 强传染性。抗-HBc IgM阳性也可见于慢性 活动性肝炎。
抗-HBc IgG ： 高滴度表明机体正感染HBV； 而低滴度抗-HBc IgG则是既往感染过HBV 的指标，具有流行病学的意义。 (非保护性抗体)
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乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价
(1) (2) (3) (4) (5) ＋ － ＋ － ＋ 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 ＋ － － － ＋ 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 ＋ － － ＋ ＋ 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 － ＋ － － ＋ 急性HBV感染康复期或有既往感染史，有
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双标记探针: Taqman probes
5’
5’
3’
Excitation Excitation
RR
Q
3’
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3’
3’ 5’ Q
5’
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1. HBV DNA 检测结果与血清标志物的综合评价
⑴ 与HBsAg检测结果的关系 :
一般来说HBsAg阳性，HBV DNA测定常常阳性。在实践 中可能遇到的问题是HBsAg测定结果阴性，而HBV DNA测定 阳性, 其原因可能是因为:

克立夫定 CLV
治疗
耐药是核苷酸类药物的共性 耐药检测的意义 ♥ 治疗前检测，有助于临床判断 用药是否有效；
♥ 治疗中每3~6个月检测，有助 于观察疗效，及时调整用药。
EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.
HBV基因分型和耐药突变基因检测的 临床应用
主 要 内 容
1
2
背景介绍
产品介绍
流行病学
乙型病毒性肝炎 是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏炎性损害。 是我国当前流行最广泛、危害最严重的一种传染病。
HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。 据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为 慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝 硬化和原发性肝细胞癌 (HCC) [1]。
诊断
♣ 临床诊断 既往有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月，现HBsAg和（或）
HBV DNA仍为阳性者，可诊断为慢性HBV感染。可分为：
慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、携带者、隐匿性慢性乙型肝炎
♣ 实验室诊断
☼ 生物化学检查：ALT、AST、血清白蛋白、PT、胆碱酯酶、AFP
☼ 血清学检查
☼ HBV DNA、基因型和变异检测：定量检测、分型和耐药突变检测
检测后的处理
----慢性乙型肝炎防治指南（2010年版） 对于接受拉米夫定治疗的患者，一旦检出基因型耐药或HBV DNA 开始升高时就加用阿德福韦酯联合治疗，抑制病毒更快、耐药发 生较少、临床结局较好。 对于替比夫定、恩替卡韦发生耐药者，亦可加用阿德福韦酯联合 治疗。 对于阿德福韦酯耐药者，可加拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦联 合治疗； 对于未应用过其他核苷（酸）类药物者，亦可换用恩替卡韦。 对于核苷（酸）类药物发生耐药者，亦可考虑改用或加用IFN类 联合治疗，但应避免替比夫定和PegIFN联合应用，因为可导致外 周神经肌肉疾病。

需要专用的软件 高，２种混合类型>30%
不能测出，100%
芯片法
可视有或无信号，直观 直观，即时
时间短，全自动化操作
3-10种混合均能
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企业愿景
--始终为广大人民健康服务 --为医疗机构提供专业化、集约化的检验服务方案
员工核心素质
• 专业 • 高效 • 诚信 • 合作
• 13
Tra ning 13
– 病毒基因一个或多个核苷酸的变异均可导致HBV编码的蛋白质发生变化，导致毒 力增强和HBV复制水平的增加，促进病毒附着/穿透。由于HBV不同区域的变异性 导致的免疫逃逸性及致病性在临床上时常发生，给乙肝的治疗和诊断带来了许多 问题。
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乙肝病毒耐药突变后对人类的危害 Traning
A 、肝硬化、肝癌发生几率增高。在乙肝治疗过程中，一旦乙肝病毒 的结构发生改 变，产生变异，就有可能发生耐药。乙肝病毒耐药一旦发生，原本对病毒有效的药 物就会失去疗效或者疗效大大下降，由此造成患者病毒反弹、血清ALT升高、疾病 进展、e抗原 血清转换率下降，同时，患者发展为肝硬化、肝癌等严重并发症的风 险也将大大增加。 B、影响 治疗效果。乙肝病毒发生变异时，常可引起药物治疗效果减低。目前多数 学者认为HBV前C区基 因发生变异时，虽药物治疗有效，但复发率增高，持久疗效 降低。 C、加重患者心理负担和精神 压力。由于乙肝病毒耐药发生之后，患者进行换药或 加药治疗易产生多药耐药，从而限制了患者 后续治疗的选择，使其陷入耐药、换药、 再耐药的迷途困境，治疗之路越走越窄。由此耐药患者 将需面临沉重的心理负担和 精神压力。而由于心理状态与免疫状态相关，严重的负面情绪甚至会 进一步导致患 者病情加重，进入“疾病与心理”的恶性循环。
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