实验五 细菌芽孢染色

实验五——细菌芽孢染色

山东大学生命科学学院09级四班

张行润

200900140177 摘要

细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于一个原则：除了用着色强的染料外，还须要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

关键词

芽孢（gemma of a fungus）芽孢染色法（Spore staining）复染（counterstain）前言

细菌的芽孢的某些细菌的特殊结构。芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或椭圆形的休眠体，它对不良环境具有很强的抗性。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴定细菌的重要依据。在一般实验室中通常用芽孢染色法来观察其形态。此外，由于芽孢具有很强的抗性，因此在生产实践中都以是否有杀死抗性最强的芽孢来评定高温灭菌及某些化学杀菌剂的效果。

一、实验目的

1.学习并掌握芽孢染色法

2.了解芽孢杆菌的形态特征

3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术

二、实验原理

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，液被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。

三、实验器材

A.菌种

枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌

B.溶液和试剂

5%孔雀绿溶液，0.5%番红水溶液

C.仪器和其它用品

酒精灯，酒精，木夹，香柏油，二甲苯，载玻片，盖玻片显微镜，香柏油，擦镜

纸和接种针等

四、实验内容

1)制片

按常规涂片、干燥、固定。

2)染色

加数滴5%孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料

冒蒸汽并开始计时。维持5min。加热过程中及时补充染液。切勿让涂片干涸。

3)水洗

待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。

4)复染

用0.5%番红染液复染1.5min 。

5)水洗

用缓流水洗后，干燥。

6)镜检

先低倍镜，再高倍镜，最后油镜观察。

五、实验结果

芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。枯草芽孢杆菌芽孢呈椭圆到柱状，位

于菌体中央或稍偏，菌体基本无大变化；梭状芽孢杆菌芽胞呈圆形，比菌体粗，

位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。

图一：枯草芽孢杆菌（10×100）图二：梭状芽胞杆菌（10×100）

芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色

六、实验分析

由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用番红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圈。但是用着色力强的染色剂孔雀绿，在加热条件下染色，使染料不仅进人菌体也可进人芽孢内，进人菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经染色便难以被水洗脱。当用对比度大的复染色剂番红染色后，芽孢仍保留初染剂孔雀绿的绿色，而菌体和芽孢囊被染成复染色剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

另外，要保证本实验获得成功，必须要注意以下几点

✓选用适当菌龄的菌种，幼龄的尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已破裂

✓加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，如热不够则难以着色

✓脱色必须等玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂

实验小结

此次芽孢染色实验，首先，收获的当然是芽孢染色方法。其次，对芽孢有了一个系统的认识，认识到了多种形态的芽孢和芽孢对于细菌的重要性，芽孢不仅仅是生物的休眠体，芽孢的各种特性还是进行生物物种鉴定和分析的重要依据，通过本次试验，我对细菌的芽孢的描述方法也有了一定的了解。相信本次实验会对以后的学习和研究等方面大有帮助。

参考文献

✧詹火元生物学通报1995年底30卷第2期p34

✧沈萍，陈向东.微生物学.第二版.北京:高等教育出版社，2006

✧沈萍，陈向东.微生物学实验.第4 版.北京:高等教育出版社，2007