新疆雪莲全长cDNA文库构建及序列分析_百替生物

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DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物

DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。

2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。

3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。

⑷ 60°C水浴1-3hr。

2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

⑵离心4000g×5min，去除上清液。

⑶加10倍体积的裂解缓冲液。

⑷ 50-55°C水浴1-2hr。

（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。

）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。

花生果皮全长cDNA文库的构建及初步分析

福建农林大学学报（自然科学版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）
（ＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｉｌａＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＣｒｏｐＭｏｌｅｃｕｌａｒｎｄａＣｅｉｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｊ衄３５０００２，Ｃｈｉｎａ）
ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＤＨ５ａｂｙｅｌｅｃｔｍｐｏｍｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｎｔｒｙｉｌｂｒａｒｙｃｏ￣ｔｍｃｔｅｄｈａｓａｈｉｇｈｔｉｔｅｒｆｏ１．３ｘ１０ｃｆｕ．ＰＣＲｒｅｓｌ１ｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎ．ｓｅｒｔｓｖａｒｉｄｅｆｒｏｍ７５０ｔｏ２０００ｂｐｗｉｔｈａｖｅｒａｇｅｓｉｚｅｌａｒｇｅｒｔｈａｎ１０００ｂｐｎｄａ９５．５％ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ．Ａｓｅｓｒｅｔｓｂｉｏｉｎｆｏｍａｒ－ｉｔｃｓｎａａｌｙｓｉｓ，ａｂｏｕｔ６８％ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｅｒｆｕｌｌ — ｌｅｎｇｔｈ．ＴｈｉｒｔｅｅｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｔｗｈｋｎｏｗｎｆｕｎｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｉｅｆｄｂｙＢｌａｓｔＸｓｅａｒｃｈｄｅａｇａｉｎｓｔｔｈｅＮＣＢＩｎｏｎ — ｒｄｕｅｎｄｎｔａｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｓ．Ｔｅｈｅｓｅ￣ｓｌｔｕｓｗｉｌｌｂｅｕｓｅｆｕｌｆｏｒｓｃｅｅｒｎｉｎｇｎｄａｃｌｏｉｎｎｇｐｅｒｉｅａｒｐｓｐｅｃｉｌａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

cDNA文库构建方法及在细胞移植等领域的应用

cDNA文库构建方法及在细胞移植等领域的应用佟春玲;陆涛峰;余露露;章嘎;巴音吉日嘎拉;关伟军;马月辉【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2009(013)044【摘要】cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的基础工具之一.且在基因分离和克隆中起重要的作用.从cDNA文库中可以筛选出所需要的目的基因,并直接用于该目的基因的表达.随着分子生物学技术的不断发展,cDNA文库构建方法有了很大改进和提高.文章介绍了cDNA文库构建基本原理和构建方法、探讨了cDNA文库构建的其他类型、分析了cDNA文库的评判标准、展望了cDNA文库的临床应用.%cDNA library is one of the basic tools to discover new gene and study gene function.It plays an important role in gene separation and cloning.Target genes are screened from cDNA libraries,and are used directly for expression.With the development of molecular biology,the methods of construction of cDNA libraries have improved and enhanced greatly.This article introduced the basic principle and methods of cDNA library construction,discussed other types of cDNA library construction to analyze the cONA library judgment standard and prospect its clinical practice.【总页数】4页(P8705-8708)【作者】佟春玲;陆涛峰;余露露;章嘎;巴音吉日嘎拉;关伟军;马月辉【作者单位】内蒙古农业大学动物科学与动物医学学院,内蒙古自治区呼和浩特市,010018;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京市100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京市100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京市100193;西北农林科技大学,陕西省杨凌农业高新技术产业示范区712100;内蒙古农业大学动物科学与动物医学学院,内蒙古自治区呼和浩特市,010018;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京市100193;内蒙古农业大学动物科学与动物医学学院,内蒙古自治区呼和浩特市,010018;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京市100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京市100193【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.全长cDNA文库及构建方法与应用进展 [J], 韩慧霞2.全长cDNA文库构建方法及应用研究 [J], 朱利军;长孙东亭;罗素兰3.人肝癌细胞移植瘤cDNA表达文库的构建及鉴定 [J], 汪磊;杜冰;吴淼;周忠良;钱旻4.心肌病大鼠骨髓间充质干细胞移植后差异表达基因cDNA文库的构建 [J], 李杨;陈沅;田杰;邱俊;朱静;张小飞5.一种构建 cDNA 文库时 Sepharose CL-4B 筛分 cDNA 的简化方法 [J], 汪洛;张迺蘅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 958−964/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 国家自然科学基金项目(30471104); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2002CB111303); 教育部新世纪优秀人才项目(NCET-04-0500); 教育部111引智计划(B08025)作者简介: 佘义斌(1981−), 男, 江苏人, 硕士, 从事作物遗传育种研究; 朱一超(1980−), 男, 江苏人, 在读博士, 从事棉花遗传学研究。

** 同等贡献。

*通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍。

E-mail: moelab@Received(收稿日期): 2007-08-15; Accepted(接受日期): 2008-01-15.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00958棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA 的克隆、表达及染色体定位佘义斌** 朱一超** 张天真郭旺珍*(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095)摘要: 腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。

通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA 文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA 序列。

该cDNA 序列长1 598 bp, 利用5′RACE 技术得到上游318 bp 的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp 的cDNA 序列, ORF 为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点p I ＝5.69, 分子量MW ＝53.2 kD 。

该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。

根据Southern 杂交结果推测GhSAHH 基因在陆地棉基因组中为单拷贝。

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。

方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。

结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。

随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。

8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。

结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。

铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。

铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。

近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。

由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。

通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。

第五章_cDNA文库的构建

3’
第二链合成
• 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
• 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。
•λZapcDNA 载体
• 优点：
1、高的转染效率
2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的质粒表达载体。
• 含有一个真核启动子
•λZapcDNA 载杂交 1、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针； 2、纯化蛋白质的相应抗体探针；
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链核酸酶S1
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
3’ 5’
cDNA 合成
缺点：合成效率低;〈1% mRNA能合成cDNA。
• 改进
• RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，
并将其降解成许多小片断。 • 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 • DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶
基本原理：
• 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上
可以分开的、功能上相互独立的结构域组成； • 应用重组DNA技术，可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的结构域分开，分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能的转录因子，
从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的
报告基因的表达。
通常由以下原因造成:
• prey蛋白的非特异性结合；
• 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。

一种构建全长cDNA文库的方法

一种构建全长cDNA文库的方法刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2007(035)005【摘要】建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA 第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.【总页数】3页(P1305-1306,1316)【作者】刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;燕山大学,环境与化学工程学院生物工程系,河北秦皇岛,066004;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】Q501【相关文献】1.适合于全长cDNA文库构建的猪苓菌核及菌丝体总RNA提取方法比较 [J], 李杨;李海娜;夏颖;刘忻壑;李艳茹;许广波2.全长cDNA文库及构建方法与应用进展 [J], 韩慧霞3.全长cDNA文库构建方法及应用研究 [J], 朱利军;长孙东亭;罗素兰4.几种全长cDNA文库构建方法比较 [J], 毛新国;景蕊莲;孔秀英;赵光耀;贾继增5.一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法 [J], 董志敏;李英慧;张宝石;关荣霞;常汝镇;邱丽娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

cDNA文库的免疫筛选

cDNA文库的免疫筛选
舒群芳;李文彬
【期刊名称】《农业生物技术学报》
【年(卷),期】1997(005)001
【摘要】本研究讨论了几种因素对成功免疫筛选的影响，其中包括基因库铺板密度，膜结合特性，封闭试剂的应用，抗体的预吸附，第二抗体的选择及抗原体检测方法等从中得出如何获得编码基因的方法。

【总页数】4页(P54-57)
【作者】舒群芳;李文彬
【作者单位】中国科学院遗传研究所;中国科学院遗传研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析 [J], 刘光远;谢俊仁;田占成;李知新;龚真莉;王路;柴慧萍;才学鹏
2.棉铃虫中肠cDNA表达文库的免疫筛选及其克隆分析 [J], 李杰;张霞;郭巍;刘小民;李新娜;赵丹
3.吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选 [J], 李有全;党志胜;鲁炳义;刘光远;白启;殷宏;罗建勋;高金亮;关贵全;马米玲;刘志杰;刘军龙;刘爱红;任巧云
4.日本血吸虫7 d童虫cDNA文库构建及免疫筛选 [J], 韩宏晓; 洪炀; 傅志强; 彭金彪; 林矫矫
5.东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析 [J], 袁忠英;沈玉娟;曹建平;沈际佳;徐馀信;刁薇;胡媛;李小红;刘述先
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cDNA文库构建技术手册

目录1 材料与方法 (1)1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 (1)1.2 Trizol法提取Total RNA (1)1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA (1)1.4 三框cDNA的合成 (2)1.5 cDNA均一化与小片段去除 (4)1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 (6)1.7 质粒转化大肠杆菌 (7)1.8 文库鉴定 (7)1.9 文库质粒大抽 (8)2 结果与分析 (9)2.1 RNA质量较好无降解 (9)2.2 ds cDNA合成 (10)2.3 ds cDNA均一化与去除小片段 (11)2.4 克隆计数 (11)2.5 文库质量鉴定 (12)附录 (14)1．材料与方法1.1 植物材料以及菌株的保存与培养1.1.1 植物材料的保存盐穗木由客户提供，存放于-80℃超低温冰箱。

1.1.2 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。

大肠杆菌于37℃培养箱中培养。

1.2 Trizol法提取Total RNA1）研钵研棒药勺用液氮预冷，样品在液氮中研磨成粉末状，转移到离心管中；2）按50-100 mg/ml trizol加入trizol，充分振荡混匀。

室温静置5 min，使其充分裂解；3）按200 μl/ml trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置10 min；4）4℃ 12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，按500 μl/ml trizol加入异丙醇混匀，-20℃放置10 min；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA沉淀于管底；6）按1 ml/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

4℃ 8000 g 离心5 min，尽量弃去上清；7）重复步骤6一次；8）室温晾干或真空干燥5-10 min，用29 μl RNase-free ddH2O和1 μl的RNase inhibitor 溶解RNA样品；9）分别吸取2 μl进行电泳检测与浓度测定。

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新疆雪莲全长cDNA文库构建及序列分析*王博李芳**王志方艾秀莲*罗明***施宠**付建红崔春生新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆乌鲁木齐830000关键词：天山雪莲cDNA文库λTripLEx2表达序列标签新疆雪莲(Sasussured involucrata Kar.et Kir.)属菊科凤毛菊属，为多年生一次性开花结实的高山草本植物，具有特殊的药用价值和开发利用价值，是我国民族药中的瑰宝〔1.2〕。

雪莲一般生长在海拔2400～4100米的高山冰渍石、流石滩、石隙、高山草甸悬崖峭壁上。

根据对雪莲的生理生殖生态的研究表明，雪莲具有极强的耐寒、抗辐射、抗风沙、抗缺氧的能力，能在高山上月平均温度仅3～5℃环境下快速生长，完成其生长史，具有很强的利用有效积温的生理功能，是天山雪线以上的唯一大型高等植物。

雪莲长年生长在极端环境下，决定了其具有许多特殊的功能基因，是分离特殊基因的极好材料。

目前大多是关于雪莲药学及化学成份分析方面的研究较多，关于其特殊功能基因方面的研究鲜有报道。

对于雪莲这些特殊基因的研究，能对雪莲生理生化的特性及极强的抗逆性状有更深层的揭示。

若将这些基因分离出来，转入棉花、水稻、玉米、各种蔬菜和草坪等植物，可产生巨大的经济效益。

也为将来的有效药用成份的相关基因，抗逆基因分离转化做技术储备。

1材料与方法1.1实验材料野生雪莲叶片采自天山一号冰川。

1.2实验试剂SMART TM cDNA文库构建试剂盒及宿主菌为E.coli XL1-Blue，载体为λTripLEx2购自Clontech公司；总RNA提取试剂盒购自上海华舜公司；包装蛋白购自Promega公司的Packgene。

其它试剂均为国产或进口分析纯。

1.3实验方法1.3.1雪莲总RNA提取与鉴定严格按照操作手册说明书进行。

提取RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，测定OD260和OD280,计算其纯度及比值。

1.3.2cDNA合成和文库构建根据RNA浓度确定RNA模板量。

按Clontech的Smart TM cDNA Library Construction Kit 使用手册进行，cDNA合成使用长距离PCR方法。

依次加入SMART IV Oligonucleotide、3＇PCR Primer及dNTP，在反转录酶作用下合成第一链。

再以第一链cDNA为模板，依次加入dNTP Mix、5＇PCR Prime、3＇PCR Primer、Advantage 2Polymerase Mix在PCR仪上进行扩增，共30个循环。

PCR产物经蛋白酶K消化、Sfi I酶切以及CHROMA SPIN-400 column大小分级。

按照cDNA：Vector=1：2/1：1/3：2三种方式进行连接。

每一个连接建立一个独立的λ噬菌体包装反应。

1.3.3文库质量鉴定事先制备好宿主菌的液体培养物，37℃，140r/min培养，直到培养液OD600至2.0。

离心，弃上清，用MgSO4重悬沉淀。

取3种连接方式不同稀释度的包装产物各100μl，分别与200μl宿主菌过夜培养物混合，在37℃培养10～15min，各加入5ml融化的LB/MgSO4上层琼脂，混合，立即倒入37℃预热的LB/MgSO4平板上，水平涂布，冷却10min，37℃培养6～18h，计数噬斑，计算滴度（pfu/ml）=噬菌斑数×稀释因子×1000/稀释的噬菌体铺板体积（μl）。

取2ml融化的上层琼脂，依次加入50μl IPTG和X-Gal贮存液、5μl不同稀释度包装产物与宿主菌的混合物，计数蓝、白斑，计算重组效率=白斑数/（白斑数+蓝斑数）。

1.3.4文库的PCR鉴定随机挑选了12个噬菌斑进行噬菌粒的转化及碱裂解提取质粒作为模板，分别依次加入5＇PCR Primer—CTCGGAAGCGCGCATTGTGTT，3＇PCR Primer—GCCCTATAGTGAGTCGTAT，Advantage2Polymerase Mix进行PCR扩增，共35个循环。

用1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.5序列获得及分析将大肠杆菌BM25.8接种于10mlLB液体培养基，31℃，150r/min摇床中培养过夜，直到OD600培养至1.1～1.4，加入100μl1M MgCl2至终浓度为10mmol/l；从平板上挑取分离较好的噬菌斑，接种于350μl1×λ稀*国家自然科学基金资助，项目批准号：30160039。

通讯作者*在读硕士***新疆农业大学合作者释缓冲溶液中，混合后37℃静置培养3～4h；在1.5ml离心管中加入200μl细菌过夜培养物及150μl噬菌体液，31℃静置孵育30min后加入400μl LB培养液；31℃，225rpm/min摇床中培养1小时，取上清5μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，于31℃培养得单菌落，用碱裂解法提取质粒DNA。

将其中120个阳性克隆穿刺培养，进行全序列测定。

所得序列去掉5＇和3＇端非编码区序列，用BLAST软件进行同源比对分析。

2结果与分析2.1总RNA提取结果分析所提总RNA经变性胶电泳，二甲苯胺蓝染色，显示二条28S和18S明显的带，说明总RNA提取较好，降解少，分子完整。

RNA OD260=0.120,其浓度为0.96μg/μl,OD280=0.063,A260nm/A280nm=1.9，表明所提RNA纯度高，符合建库要求。

2.2LD-PCR产物经LD-PCR合成的双链cDNA,5μl PCR产物进行琼脂糖电泳分析,结果0.1-4Kb呈弥散状条带,中间有几条与组织特异性高丰度mRNA相对应的亮带,说明合成的双链cDNA是成功的,符合建库要求。

2.3文库质量鉴定从表1中可以看出3号连接方式所产生的噬菌斑数最多，1号和2号连接方式所产生的噬菌斑次之。

表明3号连接方式效果最好。

按照3号连接方式10-5稀释度时形成的噬菌斑数计算未扩增文库滴度：噬斑数×稀释因子×103121×105×103μl/mlpfu/ml=———————————=—————————=4.03×107(pfu/ml)稀释的噬菌体铺板体积300ul表1未扩增文库滴度测试结果稀释倍数1号连接（噬斑数）2号连接（噬斑数）3号连接（噬斑数）10-28010不可数10-432约100010-5无无12110-6无无2用3号连接方式将样品稀释到10-5涂IPTG/X-gal平板，测出重组率为93%达到说明书所述要求。

2.4文库的PCR鉴定根据载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定，结果显示:所选12个噬菌体均含有重组的cDNA，并且均在500bp 以上。

2.5序列分析实验过程中共获得87个序列，其中插入片段长度小于150bp的序列有4个，占总测序克隆总数为4.6%，另有3个序列为空载体序列，最终获得有效序列为80个。

共有56个序列与登录在NCBI非冗余蛋白质数据库中的蛋白质序列存在显著的相似性。

其中有14个与推测的、假想的或功能未知的蛋白质序列有相似性，42个与功能已知的蛋白质序列显著同源。

表2有效序列比对结果基因库中同源产物出现频率评分比率Polyubiquitin2303156/157（99）pathogenesis-related protein7235107/142（75）Photosystem I assembly protein Yc41228109/115（94）Photosystem II phosphoprotein114271/73（97）metallothionein1397.441/53（77）tumor-related protein3214104/156（66）plant defensin protein316576/99（76）elongation factor1368179/187（95）secretory protein–like118488/181（48）splicing factor SC35120297/112（86）Eukaryotic translation initiation factor5A1301148/154（96）nuclear transport factor2–related1231110/123（89）60S ribosomal protein L241214105/112（93）NAD(P)H-quinone oxidoreductase chain3,chloroplast119998/105（93）Serine protein kinase-like118490/131（68）RNA replicase18258/154（37）Thioredoxin H114365/115（56）mitochondrial ATP synthase6KD subunit187.838/52（73）sucrose transport protein1213106/166(63)ABA-responsive protein-related113474/137(54)Threonine synthase,chloroplast precursor110451/69(73)Chorismate synthase,chloroplast precursor1342169/203(83)dormancy-associated protein-related113567/122(54)ubiquinol--cytochrome-c-reductase-related protein111454/72(75)xyloglucan endo-1,4-beta-D-glucanase1409193/304(63)1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase297.849/65(75)acid phosphatase precursor111750/65(76)Microtubule associated protein118693/108(86)3讨论本实验采用SMART（switching mechanism at5＇end of RNA transcript）技术构建了雪莲的全长cDNA文库。

SMART 是Clontech公司的一项专利：第一链cDNA合成用一个经修饰的olig（dT）引物CDSⅢprimer，SMARTⅢ寡核苷酸作为mRNA5＇端延伸出去的模板，当逆转录达mRNA5＇端时，逆转录具有模板不依赖性的在第一链cDNA3＇端加上几个C，与SMARTⅢ寡核苷酸3＇端的几个G配对，从而使寡核苷酸连接到mRNA5＇端。