区带毛细管电泳法
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毛细管电泳科技名词定义中文名称:毛细管电泳英文名称:capillary electrophoresis;CE定义1:以毛细管为分离通道、高压电场为驱动力的电泳分离分析法。
包括毛细管自由流动电泳、毛细管区带电泳等。
应用学科:生物化学与分子生物学(一级学科);方法与技术(二级学科)定义2:以毛细管为分离通道、高压电场为驱动力的电泳分离分析法。
包括毛细管自由流动电泳、毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦等。
应用学科:细胞生物学(一级学科);细胞生物学技术(二级学科)以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE),是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。
毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容,它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平,并使单细胞分析,乃至单分子分析成为可能。
长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。
目录基础理论双电层Zeta 电势淌度、绝对淌度和有效淌度电渗、电渗流和表观淌度分类特点仪器系统影响分离因素缓冲液pH值分离电压温度添加剂进样测定药物与蛋白结合常数质谱联用微全分析系统应用综述CE在药物制剂分析中的应用CE在药物杂质检查中的应用CE在中药分析中的应用CE在手性药物分析中的应用生物样本中的药物及其代谢产物分析展望基础理论双电层Zeta 电势淌度、绝对淌度和有效淌度电渗、电渗流和表观淌度分类特点仪器系统影响分离因素缓冲液pH值分离电压温度添加剂进样测定药物与蛋白结合常数质谱联用微全分析系统应用综述CE在药物制剂分析中的应用CE在药物杂质检查中的应用CE在中药分析中的应用CE在手性药物分析中的应用生物样本中的药物及其代谢产物分析展望展开编辑本段基础理论双电层双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面异号的离子层,凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。
区带毛细管电泳法测定珍菊降压片有效成分的含量【摘要】目的建立区带毛细管电泳法分离测定珍菊降压片中芸香苷、绿原酸、木犀草素、盐酸可乐定和氢氯噻嗪的含量。
方法采用未涂层石英毛细管柱(75 μm×53 cm , 有效柱长45 cm ),以20 mmol/L硼砂-5 mmol/L 磷酸二氢钠(pH 9.0)为运行缓冲液,检测波长210 nm,温度20℃。
结果芸香苷、绿原酸、木犀草素、盐酸可乐定和氢氯噻嗪分别在2.25~40.50,0.45~8.10,0.27~4.86,2.70~48.60,2.70~48.60 μg/ml浓度范围内线性关系良好,回收率和重复性良好。
结论该法快速准确,适合于珍菊降压片的质量控制。
【关键词】区带毛细管电泳珍菊降压片芸香苷绿原酸木犀草素盐酸可乐定氢氯噻嗪珍菊降压片是中西药结合治疗高血压病的常用药物,由野菊花膏粉、珍珠层粉及芦丁3味中药和盐酸可乐定与氢氯噻嗪两味西药组成。
方中野菊花可清热降火,平肝降压;珍珠层粉可平肝潜阳,安神定惊,清热明目,共为主药。
两味西药具有中枢降压和利尿降压作用, 共为辅药。
芦丁可降低毛细血管通透性,增加其张力,为佐使药。
诸药合用,克服了西药副作用大、中药起效慢的弱点,近年来日益受到高血压病患者的青睐。
目前有关珍菊降压片中有效成分的测定已有文献报道[1~5],但其中5种有效成分的同时测定尚未见文献报道。
本实验建立区带毛细管电泳法同时分离测定珍菊降压片中芸香苷、绿原酸、木犀草素、盐酸可乐定和氢氯噻嗪的含量。
1 仪器与材料 1HPCE-01高效毛细管电泳仪(山东省化工研究院);N2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所);岛津UV-2450分光光度计。
对照品(中国药品生物制品检定所,含量>99%),水为二次重蒸水,其它试剂均为分析纯。
珍菊降压片(山西亚宝药业集团股份有限公司,批号060125,060416,070128)。
2 方法和结果 2.1 对照品溶液配制分别精密称取干燥至恒重的芸香苷、绿原酸、木犀草素、盐酸可乐定和氢氯噻嗪对照品适量,以50%甲醇为溶剂制备各25 ml溶液,浓度分别为0.25,0.05,0.03,0.30 mg/ml和0.30 mg/ml。
常用分离模式毛细管电泳是指所有在极细毛细管内进行的电泳新技术,它根据分离机理不同具有多种分离模式,能够提供互不相关而又相互补充的信息。
毛细管电泳常用的分离模式包括毛细管区带电泳(CZE)或称自由溶液毛细管电泳(FSCE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)和毛细管等速电泳(CITP),各分离模式、分离机理见下表。
在大多数情况下,可以通过改变缓冲液的组成来实现不同的操作模式。
毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)是毛细管电泳中最简单、最基本、应用最广泛的一种分离模式。
在毛细管中仅填充缓冲液,基于溶质组分的迁移时间或淌度的不同而分离。
除了溶质组分本身的结构特点和缓冲液组成,不存在其他因素如聚合物网络、pH梯度或另一分配相对分离的影响。
CZE分离无需固体支持介质,不存在基质效应,能分离淌度差别很小的组分。
CZE 中由于电渗流的存在,阴、阳离子可以同时分析,中性溶质电泳迁移为零与电渗流同时流出,如下图。
CZE的特点是操作简单、快速、分离效率高,应用范围广。
从原理上讲可以适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离,分子量范围从十几的小分子离子到几十万的生物大分子。
胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱(MECC或MEKC)是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术。
MECC是在电泳分离缓冲液中加人离子型表面活性剂胶束,使电中性物质能根据其在胶束相和水相的分配系数不同而进行分离。
MECC是毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。
它是1984年由Terabe首先报道的一种新型的毛细管电泳技术,也是目前研究较多,应用较广的一种毛细管电泳操作模式。
MECC是基于胶束增溶和电迁移过程进行的,因此其分离要求有两相:一相是带电的离子胶束,是不固定在毛细管中的假固定相,它具有与周围缓冲液介质不同的电泳淌度,也可称为胶束电泳淌度(μmc),并且与分离溶质相互作用(胶束增溶过程);另一相是导电的水溶液相,在电场作用下,水相由电渗流驱动流向阴极(电迁移过程)。
实验三区带毛细管电泳法(CZE)测定中药槐米中芦丁的含量
一、实验目的
1、初步掌握毛细管电泳法的原理
2、掌握毛细管电泳仪的使用方法
3、掌握中草药定量分析的基本过程及方法
二、实验原理
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE),又叫高效毛细管电泳(HPCE)。
CE统指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。
图1、高效毛细管电泳仪示意图
1-高压电源;2-毛细管;3、4-缓冲溶液瓶;5、6-铂电极;7-检测器毛细管电泳的突出特点是:
a、毛细管电泳的仪器简单、操作简便,容易实现自动化
b、分析速度快,分离效率很高
c、操作模式多,分析方法开发容易
d、实验成本低、消耗少
e、应用范围极广
三、仪器及试剂
1、仪器
Lumex 105 高效毛细管电泳仪
JS-3050色谱工作站
TGL-16C台式离心机
WR-E型微波样品制备系统(北京美诚公司)
2、试剂
槐米,芦丁标准品,无水乙醇(AR),硼砂(AR),NaOH(AR),二次蒸馏水。
四、实验步骤
1、样品溶液制备
(1)草药槐米经烘干、粉碎,过40目标准筛。
准确称取0.10g粉末于于50mL
锥形瓶中,加入10ml乙醇,微波萃取10min。
萃取结束后,萃取液经过抽滤除去固体后,蒸干,用无水乙醇定容至25ml。
(2)将定容后的槐米提取液分装至2个5ml的离心管中,在6000rpm的转速
下离心10min,取离心后的上层清液,将滤液收集合并,保留大约4ml溶液,冷冻保存,即为待测液。
2、缓冲溶液配制
(1)准确称取Na2B4O7.10H2O固体9.5343g,在100ml的烧杯中用二次水溶解
(需水浴加热),待固体全部溶解并冷却至室温后,定容至250ml,即得到0.1mol/L 的Na2B4O7溶液。
(2)用移液器取0.1mol/L的Na2B4O7溶液100μl用二次水稀释配制成
10mmol/L的溶液1ml,稀释两份,置于1ml离心管中,用作电泳缓冲液。
3、毛细管电泳仪的操作要领
(1)开机预热20min。
(2)设定工作温度为25o C。
(3)每天毛细管使用前须依次用0.5mol/LNaOH溶液冲洗5min,二次水冲洗
5min,冲洗之后两端用二次水液封。
(4)每次电泳前,须用二次水冲洗2min,再用缓冲液冲洗2min。
(5)本实验的进样条件为30mPa压力,10s时间。
(6)电泳运行条件为15KV,20min,在启动高压的同时,色谱工作站的记录
系统也触发开始。
(7)电泳结束后,在计算机的色谱工作站软件内保存好色谱图,并打印输出。
4、槐米中芦丁含量测定
(1)取槐米样品溶液100μl,置于1ml离心管中,加入20μl 的0.1mol/l
Na2B4O7溶液和880μl二次水,扣紧离心管盖子,摇匀并在离心管上做标记。
(2)将装有配制好的样品溶液和缓冲溶液的1ml离心管放入离心机中,在
6000rpm的转速下离心脱气10min。
(3)离心后得到的10mmol/L的Na2B4O7溶液即为本实验的运行缓冲溶液,做
标记的样品溶液即为电泳仪可检测的样品溶液。
(4)照前述电泳条件测定该样品溶液,得到谱图保存并打印。
5、芦丁标准曲线
准确配制0.005mg/ml,0.05mg/ml,0.1mg/ml,0.2mg/ml,0.6mg/ml,1.0mg/ml 的芦丁标准品溶液,分别在前述电泳条件下做检测,得到一系列谱图,保存。
五、数据处理
1、绘制标准曲线。
根据芦丁标准品的电泳谱图,得到在此电泳条件下,芦丁的保留时间,同时从谱图上可计算出芦丁的峰面积。
由芦丁峰面积与芦丁浓度的对应关系,绘制“峰面积——浓度标准曲线”。
2、从待测样品谱图中,根据峰保留时间确定芦丁峰,记录该峰的峰面积,从标准曲线上查得对应的浓度值。
经过计算得出槐米生药中的芦丁质量百分含量。
标准曲线方程:Y=12.325+1652.875X
六、思考题
1、简要说明毛细管电泳法(CE)同液相色谱法(LC)的区别与联系。
2、进入毛细管电泳仪的溶液,为什么必须经过离心脱气这一步骤?如果没有脱气,将会对实验结果产生什么样的影响?
3、微波萃取结束后,为什么要等到冷却之后才能开罐?
七、参考文献
1、付若农等编著,近代色谱分析,国防工业出版社,1998年
2、邹汉法等编著,毛细管电色谱及其应用,科学出版社,2001年
3、国家药典委员会编,中华人民共和国药典(一部),化学工业出版社,2000年版
附录:Lumex Capel 103R 毛细管电泳仪简介
图2、Lumex Capel 103R 毛细管电泳仪1—高压块挡板
2—指示面板
3—分离盒盖板
4—装有毛细管的分离盒
5—显示器
6—控制面板
7—电源开关
8—可动支持套拉杆
9—支持套提升杆
10—可拆卸高压块
11—隔离高压挡板。