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氨基酸分析仪原理、分类及几种氨基酸分析仪的比较概述氨基酸分析仪是一种分析仪器，采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。
工作原理通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。
其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。
应用全自动氨基酸分析仪主要应用:各种物质中18种氨基酸的定性定量分析。
1.饲料上的应用：质量控制：各种饲料必需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当，测定原料和产品中的氨基酸含量，以达到保证质量的目的。
真伪鉴别：鱼粉氨基酸组成特点是赖氨酸、蛋氨酸含量高，氨基酸分析结果很容易就可以区别它的真伪。
2.农业、食品、饮料及玉米、大豆、小麦等农作物的氨基酸含量进行检测；对果汁、饮料进行真伪的鉴别；检验测定茶氨酸来鉴别真伪茶叶；对酱油级别的认定。
分类氨基酸分析仪按其分离和检测方法的不同可分为两大类型。
第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生光度法测定的经典方法（IEC）。
此类方法于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
第二类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法（HPLC）以及阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法（IC）。
选型指南1、原理。
基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）。
此类方法由Stein和Moore两人1958年发明，并于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指标。
满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求，而其中的分离度又是更为重要的指标，因为，色谱理论一般以分离度达到1.2作为两峰基本分离的判定前提，只有峰分开了，才有意义去讨论定性和定量的重复性。
文章编号:1004-7964(2004)03-0039-05收稿日期:2003-11-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)经费资助,课题编号:2001AA 647020四川大学青年基金,课题编号:H2002[9-057]第一作者简介:戴红,女,1966年出生,副教授。
主要研究方向:分析检验。
氨基酸分析的检测方法评述戴红,张宗才,张新申(皮革化学与工程教育部重点实验室(四川大学),四川成都610065)摘 要:对氨基酸分析常用的化学方法、电化学方法、分光光度法(包括可见光分光光度法,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等检测方法进行综述,以期为提高氨基酸分析的灵敏度、准确性,为快速、高效的氨基酸分析方法的建立提供参考。
关键词:氨基酸;检测;分析中图分类号:Q517;Q 503 文献标识码:ADete rmination Methods of Amino Acids AnalysisDAI Hong ,ZHANG Zong -cai ,ZHANG X in -shen(Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering(Sichuan University ),Ministry of Education ,Chengdu 610065,China )Abstract :Determination methods for amino acids ,including chemistry determination ,elec -tric -chemistry determination ,spectrophotometer determination and co nductivity detectionmethod w ere review ed fo r the sake of improving the analysis sensitivity and accuracy .The paper aimed at providing useful reference to building a fast and effective amino acids aualy tic methods .Key words :amino acid ;analysis ;determination 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质,氨基酸分析技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义,广泛地应用于化工、轻工、食品加工、医药卫生行业的医药、食品、保健品等的分析,并且用于皮革化学鞣革机理的研究中[1,2,3]。
AA3 连续流动分析仪（流动注射分析仪)仪器简介：连续流动化学分析技术（Contin uous-Flow Analys is-CFA）的设计理念于1957年被提出，并于1960年由美国T echni con公司正式生产出世界第一台应用此技术的仪器，定名为自动分析仪（AutoAn alyze r），当时型号为A utoAn alyze r I。
从此，AutoAn alyze r作为Te chnic on的商标成为CFA的代名词。
由于它能将大多数复杂的化学反应固定在一台被精密控制的仪器上，完全自动地，快速准确地进行，因此很快成为大多数工业行业通用的标准化学分析方法。
它采用连续流动的原理，用均匀的空气泡将样品与样品分开，标准样品和未知样品通过同样的处理和同样的环境，通过对吸光度的比较，得出准确的结果。
系统由自动进样器，蠕动泵，化学分析盒，比色计，计算机和打印机组成。
1969年T echni con推出了功能更强大，结构更完善，操作更方便的AutoA nalyz er II,1988年德国布朗卢比公司收购了Techn icon，继续致力于C FA的研究和开发。
1997年德国布朗卢比公司推出的AutoA nalyz er 3已经能进行在线消解，在线溶剂萃取，在线蒸馏，在线过滤，氧化还原，在线离子交换，自动稀释，自动进样，WINDOW S/NT下全计算机自动系统控制软件，结果自动报表打印，多功能化学分析盒，高低量程转换，不用装电子除气泡装置等多种改进。
目前该仪器已广泛应用于农业、环保、自来水、烟草、化工等行业。
在国内已有三百多家用户。
典型应用：土壤及提取物：硝态氮，亚硝态氮，氨态氮，磷酸盐，硅酸盐，硫化物，硫氰酸盐，硼化物，氯，总氮，游离氰，总磷，钾，钙，镁，钠，锰，尿素，来，赖氨酸，葡萄糖烟草及成品：尼古丁，总糖，还原糖，氯，钾，挥发碱，挥发酚，硝酸盐，总凯式氮水及污水：硝酸盐，亚硝酸盐，氨氮，磷酸盐，总氮，总磷，硅酸盐，氯，硫酸盐，苯酚，氰化物，硫化物，阴离子，DOC,COD，硬度，酸度，碱度，铁，镁，铝，氟，尿素食品谷物：维生素B1，B2,B3，VC,蛋白，钙，铁，硫，碘化物，安息香酸，山梨酸，谷氨酸，尿酸，果糖，葡萄糖，淀粉，总糖，还原糖，总氮，总磷饮料和啤酒：VC,二氧化碳，二氧化硫，总糖，糖精，柠檬酸，安息酸，山梨酸，磷酸，多酚，游离氨基氮，总糖，咖啡因，苦味值，双乙酰，淀粉酶等牛奶及制品：VA,VC，钠，钾，氯，游离脂肪酸酸度，碱性磷酸酶，半乳糖，乳糖，硝酸盐，亚硝酸盐，丙酮，丙酮酸盐，尿素，蛋白，碘化物，硫酸盐等肉类及鱼肉制品：硝酸盐，亚硝酸盐，磷酸盐，VC，总氮，总钙，总磷，羟吉普；、羟基脯氨酸，二甲胺，三甲胺等主要特点：1. 流动分析仪行业中历史最为悠久，目前市场上唯一采用模块化设计：自动取样器、蠕动泵、化学模块、检测器均相互独立，便于仪器操作及扩展。
氨氮在线分析仪使用说明书使用安全说明一、总则请在开机运行前认真阅读本手册，并严格按照本手册说明进行操作，尤其注意所有有关危险和谨慎问题的说明，请不要擅自维修、拆装仪器上任意组件，否则可能会导致对操作人员的严重伤害和对仪器的严重损伤。
二、触电与灼伤预防1、维护或修理前务必断开电源；2、按照地方或国家规则进行电力连接；3、尽可能使用接地故障断路器；4、在连接操作条件下将操作单元接地，接地电阻≤10Ω。
5、化学药品危险预防。
本设备所需的部分化学药品为有毒有腐蚀性物质，在处理这些药品时，请参照本手册试剂章节中的相关内容，采取一定的预防措施。
不正确的使用仪器或其部件以及/或其附件会导致人身伤害、仪器损坏或污染。
因此一定要确保正确使用仪器和/或其部件以及/或其附件。
仪器是专门为了测量经过处理的水溶液中的NH3-N而设计的（废水、过程水和地表水）。
目录使用安全说明 (2)一、总则 (2)二、触电与灼伤预防 (2)第一章、技术参数 (4)第二章、概述 (5)一、基本原理 (5)二、产品特点 (5)三、系统描述 (5)四、测量步骤 (8)第三章、安装 (9)一、拆箱检查 (9)二、安装要求 (9)三、通讯连接 (10)四、接线端子示意图 (10)五、取水预处理装置 (11)第四章、运行 (12)一、试剂准备 (12)二、软件介绍 (13)第五章、维护 (19)一、清洗 (19)二、调零 (19)三、冲洗 (20)四、校准 (20)五、零样测量 (21)六、标样测量 (21)七、试剂更换 (21)八、长期不运行 (22)九、配件更换 (22)十、废液处理 (22)第六章、常见故障及解决 (24)第一章、技术参数测量方法测量范围mg/L测量准确度10％测量重复性5％显色时间，20min，30min可设测量间隔1、2、3…24小时，也可通过modbus触发仪器校准尺寸（mm）重量（不包括试剂）操作及存储温度℃，湿度<95%，无结露电源及功率AC±10%，50~60HZ，100W输出路4-20mA输出个多功能输出继电器用户维护天试剂用量天（全天24小时连续做样，校准周期24小时）预热时间小时其他仪器尺寸图:第二章、概述一、基本原理本仪器采用纳式试剂比色法来测量水体中的以游离态的氨或铵离子存在的氨氮。
日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易操作规程一、联机1、打开电脑。
2、打开主机电源。
3、双击桌面的图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。
1-14、在菜单栏中依次点击和，出现1-2画面，单击联机。
大约两分钟，初始化完毕。
中Uninitialized变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。
初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升。
分离柱的温度会升到50℃。
1-21-3二、手动各组件控制操作1、泵1和泵 2点击，出现2-1的画面。
设置泵1，流量0.ml/min，B1 100%。
点击打开泵1。
泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。
点击打开泵2。
泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-22、自动进样器点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
2-32-43、反应柱柱温箱点击，出现2-5画面，设置柱温135℃，设置ON，打开柱温箱。
柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。
2-52-6三、编辑方法1、依次点击、、出现3-1-1的画面。
3-1-12、选中，点击。
再依次点击、，出现3-1-2的画面。
3-1-23、在设置中选中各个柱，其余参数默认。
4、将方法另存为L8900分析方法，文件名及路径均可自选。
注意一定不要覆盖原来的方法，一定得另存。
注意将梯度设为3-3-1所示，其余参数默认。
3-3-12、保存方法。
四、编辑Sequence1、依次点击、、，出现4-1画面。
选中，其余参数默认。
4-12、点击，出现4-2画面，根据需要填写各个参数。
4-23、点击，出现4-3画面，根据需要填写各个参数。
4-34、点击，出现4-4画面，根据需要填写各个参数。
4-45、点击，出现4-5画面。
4-56、通过复制、编辑，最终将Sequence编辑如图4-6所示。
注意此时第一行是再生程序（RG），进样体积为0，Run Type是Unknown，第二行是标准样品，三行起是未知样。
氨基酸自动分析仪氨基酸是蛋白质的组成成分，是蛋白质化学研究的主要内容之一。
蛋白质是一切生命物质的基础，因此，探讨和揭示生命现象的发生、生长、新陈代谢、遗传变异过程，都与氨基酸的研究有关。
随着近代物理学、化学和电子学的飞速发展，氨基酸的分析技术亦在不断更新。
氨基酸分析仪是本世纪50年代研制的，仅40多年，已发展到现在的进样、分离、检测和数据处理全部自动化的程度。
检出量由微克分子到毫微克分子，分析时间由原来的24小时到现在的半个小时，分析技术的提高促进了其他科学领域的发展。
一、氨基酸自动分析仪的进展用于氨基酸分析的方法很多，有纸色谱法、柱色谱法、薄层色谱法、电泳法及气相色谱法等。
一般认为离子交换柱色谱法是较为精确的检测方法，氨基酸分析仪就是在此基础上研制成功的。
1951年Moor和Stein采用离子交换树脂色谱，用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计，后来在Spaekman的协助下，使分析操作自动化。
迄今氨基酸分析仪的条件和自动程度有了很大的改观，其特点主要表现以下几个方面。
⒈树脂粒径减小近年来制成的小颗粒球状树脂，使氨基酸分析仪得到很大改进。
由于树脂粒径减小就对应地增加等量树脂的总面积，使现在少量树脂达到过去大量树脂的分离效果，从而减小了树脂柱的内径和体积，节省了试剂用量，缩短了分析时间。
树脂的粒径从200→20→10→5µm。
⒉色谱柱内径缩小树脂粒径减小使填充树脂床的色谱柱内径减小，由过去的粗长柱变为微柱。
色谱柱内径的变化为18→6→2.8→1.75mm。
⒊输压泵压力增高一般氨基酸分析仪采用低压泵，其施加于输液的压力只有几9.80665×104Pa，以后增加至几十9.80665×104Pa，现在发展到2068×104Pa。
⒋分析时间缩短由于树脂粒径的改善，色谱柱内径缩小和泵压增高，使分析时间大大缩短。
蛋白质水解液的分析时间从过去的24小时缩短到现在的半个小时左右。
⒌仪器灵敏度提高由于仪器的不断改进，使灵敏度大为提高，过去仪器的最高灵敏度已远不及现在仪器的最低灵敏度。
现在一般氨基酸分析仪的灵敏度均达到0.1nmol。
⒍试剂用量减少由于分析时间大大缩短，致使试剂消耗量大为降低。
氨基酸分析的试剂要求纯度很高，且价格昂贵，试剂用量减少会降低分析费用，试剂流量(每小时茚三酮试剂的用量)的变化为70→35→18→3.5ml。
⒎样品用量少由于仪器灵敏度不断提高，同时不少仪器采用单柱分析法，所以样品用量逐渐减少，从过去一次分析需要样品几ml到现在只用20µl。
这对科研中难以收集和制备的样品以及许多生物样品的微量分析提供了十分有利的条件。
⒏自动化程度提高由于采用多样品自动注入器、程序控制和数据处理系统，使仪器从进样到每个氨基酸结果打印的全过程都自动化。
并且当仪器出现故障时又能自动停机，因此可以自动地进行工作。
⒐显色试剂和检测器的改善显色试剂中除了茚三酮仍被广泛应用外，荧光试剂受到人们的重视。
以前认为很有发展前途的荧光胺已被邻苯二甲醛所取代。
目前用邻苯二甲醛的荧光计检测器检测的灵敏度比用茚三酮显色后经分光光度计检测的灵敏度高100倍以上。
二、氨基酸分析原理⒈氨基酸的理化特性氨基酸是无色的结晶物质，氨基酸分子()至少有一个氨基和一个羧基，在水溶液中呈中性、弱酸性或弱碱性，是两性电解质，它所带的电荷随介质pH而变化。
当氨基酸处于H+介质中，羧基的解离作用被抑制，整个分子获得一个质子带正电荷；反之，当它处于OH-介质中，则从氨基夺走一个质子，从而整个分子带负电荷。
当处于某一pH下，两性离子所带正负电荷数相等时，此时的pH值就是该氨基酸的等电点，整个分子呈电中性。
一般氨基酸都能溶于水和其他极性溶剂，而难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。
由于氨基酸结构不同，等电点亦有差异。
氨基酸等电点是取决于其羧基和氨基的解离常数的相对值。
由于羧基的解离常数大于氨基酸的解离常数，故一般氨基酸的等电点为弱酸性。
由于氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它们都能产生氨基和羧基的一般化学反应，如酯化、甲基化、乙酰化以及酸碱中和反应等。
这里仅就氨基酸分析仪采用的与茚三酮试剂显色反应加以描述。
氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解为CO2、NH3和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。
在弱酸性溶液中(pH=5)，还原茚三酮与NH3及另一个分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物茚二酮炔―茚二酮胺(DYDA)。
反应式为：由于DYDA在570nm处有最大吸收峰，所以广泛地用于氨基酸比色测定。
唯脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440nm处有较强的吸收峰。
⒉离子交换树脂离子交换色谱是以液体作为流动相，用离子交换树脂装在柱内作为固定相，与适当的检测器连接起来的专用液相色谱法。
其基本原理与离子交换色谱相同。
各种氨基酸的酸碱性、极性和分子结构不同，常用阳离子交换树脂在色谱柱上分离，可用不同的pH值和离子浓度的缓冲液依次将它们洗脱，酸性氨基酸先被洗脱下来，其次是中性和碱性氨基酸，同类型的氨基酸，分子量较小的先洗脱出来。
由于氨基酸不吸收可见光，故洗脱液需与茚三酮反应显色后才能检测，最后根据检测信号的大小计算各种氨基酸的含量。
离子交换树脂有以下类型：⑴阳(酸性)离子交换树脂凡是含有酸根的树脂为阳离子交换树脂，这类树脂又可分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类。
强酸型含有磺酸基团(―SO3H)；中强酸型含有磷酸根(―PO3H2)、亚磷酸根(―PO2H2)；弱酸型含有羧基(―COOH)或酚羟基(―OH)。
以上这些交换树脂在交换时反应机理如下：⑵阴离子交换树脂阴离子交换树脂都含有氨基，它可分为强碱型、中碱型和弱碱型三类，如含季胺盐[―N+(CH3)3]为强碱型；叔胺[―N(CH3)2]、仲胺[―NHCH3]、伯胺类为弱碱型。
既含强碱基团也含弱碱基团的交换树脂是中强碱型树脂。
交换反应如下：强碱型R―N+(CH3)3OH-+Cl-→R―N+(CH3)3Cl-+OH-弱碱型R―N(CH3)2+H2O→R―N+(CH3)2H+OH-R―N+(CH3)2H•OH--+Cl-→R―N+(CH3)2HCl+OH-以上所列离子交换树脂含有一个分子的不溶基底物质及一个活性根，但这些活性根的存在会增加物质的溶解度，一般的方法是在树脂中加入“交联结构”，使它成为一个高分子量的大聚合物，上下左右索扯固定，不能溶解。
氨基酸分析仪所用的强酸型阳离子交换树脂是由苯乙烯及二乙烯苯合成的，其中苯乙烯是主要成分，磺酸根联结在其上，形成磺化苯乙烯。
二乙烯苯是用来做交联结构的，它把直链结构的磺化苯乙烯错综地连贯起来，防止因吸水溶解而溃散。
磺化苯乙烯与二乙烯苯的聚合如图1.4.1所示。
使用离子交换树脂应注意交联度，即二乙烯苯占树脂单体的百分率。
交联度大，树脂的结构紧密，空隙度、渗透性以及溶胀性较小，适应于分子量较小的氨基酸分离；反之交联度小的树脂，结构疏松，空隙度、渗透性及溶胀性大，在离子交换中结构不稳，高压的洗脱液会把这种树脂破坏，氨基酸分析所用的树脂交联度为8%～12%。
目前，国外各厂商都有自己的树脂，配制方法均属专利产品，所以树脂的售价昂贵。
⒊氨基酸自动分析仪原理氨基酸分析仪是在离子交换色谱的原理指导下制成的，是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪。
它的结构一般是由色谱系统、自动加样系统、检测系统、控制系统、数据处理系统组成。
如图1.4.2所示，流程图的主要部件有，进行氨基酸分离的离子交换树脂色谱柱；分离的各个氨基酸与茚三酮试剂反应的水浴(100℃±1℃)；用于检测氨基酸显色的比色计及记录仪和数据处理系统；输送缓冲液和茚三酮试剂的恒流泵；缓冲液自动转换阀；自动进样器；保持色谱柱分离温度的恒温水浴。
用于氨基酸分析的样品都需用pH2.2的缓冲液溶解或配制，由于pH2.2都较各种氨基酸的等电点小，即各氨基酸都处于[H+]浓度很大的酸性溶液中，这样的溶液有利于氨基酸的氨基(―NH2)电离，而不利于羧基(―COOH)的电离。
因此，在pH2.2的缓冲液中各氨基酸呈R―CH―COOH状态，带正电荷。
柱里的磺酸型阳离子交换树脂R―SO3-H+被柠檬酸钠(生理体液为柠檬酸锂)缓冲液平衡时形成R―SO3-Na+。
当带正电荷的氨基酸进入色谱柱前端，此时氨基酸浓度处于最大值，氨基酸与Na+进行如下交换：由于缓冲液的流动以及氨基酸的吸着，氨基酸在流动相中的浓度下降，这时氨基酸就会解吸，这种解吸作用使交换树脂恢复到原来的形式。
这样当氨基酸通过离子色谱柱时，连续地吸着与解吸，加之各种氨基酸彼此性质不同，吸着的程度就有差异，在缓冲液的作用下便形成了分离。
当逐渐提高洗脱缓冲液的pH值时，氨基酸的正电荷逐渐减少，与树脂的结合力逐渐减弱，最后从离子色谱柱被洗脱下来。
氨基酸的结构不同，与树脂的结合力也有差异。
酸性氨基酸所带的氨基少，正电荷也少，与树脂结合不紧，它容易被洗脱下来。
如天门冬氨酸，是第一个洗脱下来的氨基酸，其等电点为：天门冬氨酸等电点(pI)=½(2.1+3.9)=3.0相反，赖氨酸所带的氨基(―NH2)多，在pH2.2缓冲液中，正电荷多，它与树脂结合紧密，被Na+置换困难，故洗脱下来的速度就慢。
赖氨酸的等电点(pI)=½(9.0+10.5)=9.75氨基酸侧链除具有氨基和羧基外，有的氨基酸还带有其他基团，这些基团在一定条件下也能离解，如酚羟基(酪氨酸)、咪唑基(组氨酸)及胍基(精氨酸)等，在一定条件下，这些基团的解离状态及它们对树脂的亲和力和被洗脱的速度是有区别的，这些区别是各氨基酸在色谱柱被分离的基础。
不同氨基酸与离子交换树脂亲和力的强弱如下：碱性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羟基氨基酸。
因此，氨基酸的分离便有先后顺序，一般酸性及带羟基的氨基酸最先洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。
图1.4.3是Beckman 121MB型氨基酸分析仪蛋白质水解液中各氨基酸的出峰顺序。
氨基酸的分离是用不同pH值的缓冲液进行的，一般标准分析(蛋白质水解液分析)采用柠檬酸缓冲液，如果分析生理体液(如尿、血浆、乳汁、脑脊液及动植物组织提取液等)则该为柠檬酸锂缓冲液，因为天门冬酰胺与谷氨酰胺在钠盐缓冲液中不易分离，两者重叠成一个峰，不能得出各自的结果。
标准氨基酸分析(蛋白质水解液分析)，Beckman 121MB型一般使用三种缓冲液。
即pH3.28洗出天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、丙、胱、缬等氨基酸；pH3.90洗出蛋、异亮、亮、酪、苯丙等氨基酸；pH4.95洗出赖、组、精等氨基酸。
除以上缓冲液外，还有再生液，浓度为0.2mol/L NaOH。
每做完一个样品，仪器自动吸入再生液，将柱子冲洗干净后，再做第二个样品。
