溶菌酶研究现状
2010级基地班马冬珂10104109
关键词：溶菌酶基本性质活性检测酶学性质提取，分离，纯化纯度检测一：溶菌酶的基本性质：
１９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。【1】
作用机制：
溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的β—１，４糖苷键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下，细胞胀裂，细菌裂解，而人和动物细胞无细胞壁结构，也无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用，但具有溶解细胞壁的能力。【2】
溶菌酶分子量的测定：
溶菌酶原料相对分子质量测定采用ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳法测定，分离胶浓度为１２％，采用考马斯亮蓝染色。
溶菌酶是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
应用：
在国外，溶菌酶普遍的应用在食品的杀菌，保险，防腐以及微生物发酵和生物工程技术中菌体内容物的提取，如核酸，蛋白质，抗生素，酶等的提取，在医药和临床上，溶菌酶制成的各种药物具有抗菌抗病毒，消炎消肿，增强抗生素疗效等作用，检测血清尿中的酶的活性，临床上可用于诊断白血病。【13】
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。【10】由于溶菌酶能破坏革兰氏阳性菌的细胞壁而具有杀菌能力。因此在医学临床上是有效的消炎剂。可用于阻止流感、清除坏死组织等;另外,若将溶菌酶加在鲜牛奶或奶粉中,可增强婴儿的免疫力;作为防腐剂加入到饮料、糕点和肉制品中,可延长商品的货架期。另外,在基因工程和细胞工程上,也大量使用溶菌酶以制造和提取菌体内活性物质。【14】
前景：
溶菌酶有广阔的应用前景。提取溶菌酶，是一项生产简单、投资少、见效快的开发项目，有巨大的经济价值。溶菌酶在医学和酶工程上的应用正方兴未艾。当前，溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，还存在很多的问题。可以预见，溶菌酶将发挥越来越大的作用。
二：溶菌酶的活性检测：
（1）酶活力测定方法：
由于原材料不同,提取方法不同,应用时底物条件(如pH、温度等)的差异性往往影响溶菌酶的活力,因此在制取和应用溶菌酶的过程中随时要测定其活力。目前测定溶菌酶活力的方法主要是采用溶壁微球菌作底物,通过酶作用前后吸光度的变化来表示。方法繁琐,常常要先培养菌体,给测定带来许多不便,限制了它的使用。用壳聚糖代替细菌作底物,免去细菌培养过程,简便了测定程序。由于溶菌酶可以内切的方式作用于壳聚糖,断开糖链上的β-1,4糖苷键。因此,通过测定溶液中的还原糖浓度,可间接求出溶菌酶活力及酶反应速度。【8】酶活力的测定采取溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性的经典方法。然后计算酶活力的单位：
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001 比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法分析溶液中可溶性蛋白的含量。取50uL 的样品液加进2.5mL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5min后，在595nm 波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。（由标准曲线求得的回回方程为：酶样蛋白含量：b(mg/mL)=1.674×A595nm-0.0354
另外，终点法，动力法，紫外可见分光光度法，荧光分光光度法，酶偶联法，电化学法也可以测定酶活力。
（2）酶活力单位定义：
酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。
其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。
另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。
Kat和U的换算关系：1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat
（3）比活力定义：
酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。
（4）蛋白质含量测定方法：
①凯氏定氮法：蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。定氮法比较繁复，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白。
②双缩脲：将两分子尿素分子加热脱去一分子氨而形成的就是双缩脲NH2-CO-NH-CO-NH2 双缩脲在碱性溶液中与CU2+结合形成紫红色络合物，这样的呈色反应，称之为双缩脲反应因为蛋白质含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-),也可以在碱性条件下与CU2+进行双缩脲反应，生成紫红色的络合物。且在540nm 处的吸光度与蛋白质的含量在10—120g/L这个范围内有良好的线性关系。
③Folin-酚试剂法（Lowry法）：此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋
白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质
中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测方法，最低灵敏度为5微克，通常测定范围20－250微克。优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干扰物质较多。
④BCA法：其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery 法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法（考马斯亮蓝）相比，BCA 法的显著优点是不受去垢剂的影响。
⑤紫外吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后样品仍能回收利用。缺点是准确度较差，干扰物质多，用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。
⑥考马斯亮兰法（Bradford法）：双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经
