β-地中海贫血基因检测标准操作规程
- 格式：doc
- 大小：112.50 KB
- 文档页数：8
下载文档原格式
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
某医院检验科
作业指导书
WORK INSTRUCTOR
标题：β-地中海贫血基因检测标准操作规程
β-地中海贫血基因检测标准操作规程
1原理
采用PCR 体外扩增和DNA 反向点杂交相结合的DNA 芯片技术：。 2
器材
2.1 试剂
2.1.1 全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA 快速提取试剂盒（25人份/盒）。
有效期：1年。
2.1.2 亚能β-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。
主要组成： 储存条件：试剂盒Ⅰ保存在﹣18℃以下；试剂盒Ⅱ保存在2～8℃。 有效期：6个月。 2.1.3 自备试剂：
2.1.
3.1 20×SSC （pH 7.0）
NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g
加蒸馏水 750mL 溶解，用pH 计调pH 至7.0，最后定容至1000mL ，并高压灭菌保存。
试剂盒Ⅰ
PCR 反应液 25管 23L
试剂盒Ⅱ
膜条 25张 POD 母液
1管 75L TMB 1瓶 10mL 矿物油 1管 1mL 30％ H 2O 2
1管
75
L
2.1.
3.210% SDS（pH 7.0）
SDS 20g
加蒸馏水 180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。
2.1.
3.31M柠檬酸钠（pH 5.0）
柠檬酸钠294g
加蒸馏水 700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。
2.1.
3.4A液（2×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）
20×SSC 100mL
10% SDS 10mL
加蒸馏水定容至1000mL
2.1.
3.5B液（0.5×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）
20×SSC 25mL
10% SDS 10mL
加蒸馏水定容至1000mL
2.1.
3.6C液（0.1M柠檬酸钠，pH 5.4）
1M柠檬酸钠 100mL
加蒸馏水定容至1000mL
2.1.
3.7显色液（新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液）
C液 19 mL
TMB 1 mL
30% H2O2 2μL
2.2仪器
某公司某型移液器
某公司某型离心机
某公司某型生物安全柜
某公司某型PCR仪
某公司某型水浴锅
某公司某型分子杂交仪
某公司某型水平摇床
某公司某型扫描仪
3操作规程
3.1DNA提取
3.1.1在1.5mL离心管中加入800L裂红液及100L抗凝全血，充分混匀，室温放置2～
3min，8000rpm离心2分钟，弃去上清，小心保留管底沉淀。
3.1.2加入10μL变性液A和250μL充分摇匀的变性液B，充分混匀，室温放置5分钟，
8000rpm离心5秒钟，弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。
3.1.3向沉淀中加800μL洗涤液I，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小
心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀（沉淀无色透明）。3.1.4往管中加入800L洗涤液Ⅱ，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8,000rpm离心5秒钟，
小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。
3.1.5往管中加入800L无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8,000rpm离心5秒钟，
小心弃去上清。用吸头吸弃残液，小心保留管底沉淀。（注：多洗涤一次可有效提高
DNA纯度）
3.1.6沉淀置于真空旋转干燥仪中60℃干燥约10min或金属浴干燥约35分钟，当沉淀完全
干燥成白色粉末后加入100L溶解液，旋涡震荡混匀，60℃保温10分钟，，8,000rpm
离心5秒钟(使用13000rpm离心5分钟可提高DNA纯度)，上清即可做为PCR模板。
3.2PCR扩增
3.2.1样品数为n，则取出n+1管PCR反应液，其中一管为阴性质控。
3.2.25,000rpm离心2秒，在管壁上做好标记，而后分别加入已提取的待测样品DNA 2L，
反应总体系为25L。
阴性质控：以2L纯水为模板，作空白对照。
3.2.3每管滴入一滴矿物油，按以下条件进行扩增：
50℃ 15min
95℃ 10min
94℃
55℃ 30s 循环35次
72℃ 30s
72℃ 5min
3.3杂交
3.3.1取15 mL 塑料离心管，放入标有编号的膜条（应在膜条的一角标记），加入A液5~6mL
及所有（25μL）PCR产物，将盖拧紧，再将离心管盖稍拧松，以避免加热时管盖爆开。
3.3.2将离心管放入沸水浴中加热10分钟（确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下）。3.3.3取出拧紧盖子，放入杂交箱42℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。
3.3.4往50mL塑料管加入40mL B液，放置于杂交箱或水浴箱中，预热至42℃。
3.4洗膜
取出膜条，移至装有预热B液的50 mL管中，于42℃轻摇洗涤15分钟（每管40mL 溶液，最多可同时洗涤4张膜）。
3.5显色
3.5.1酶标液的配制：POD:A液以1: 2000的比例配制POD溶液（1张膜条1微升POD）