1株貂源绿脓杆菌噬菌体的分离与鉴定

貂源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究杨青;石有斐;陈静;王苗利;徐鸿;王贵升【摘要】为了初步探究山东省貂源大肠杆菌耐药性及耐药基因情况,对30日病死貂脑组织分离得到的大肠杆菌进行O抗血清型鉴定、药敏试验及耐药基因检测.结果显示,该分离菌血清型为O114,且对多种药物产生耐药,并携带至少3种耐药基因.试验所分离的貂源大肠杆菌能够穿过血脑屏障,耐药性严重且存在交叉耐药现象.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2015(049)008【总页数】6页(P14-19)【关键词】大肠杆菌;分离鉴定;血脑屏障;耐药基因【作者】杨青;石有斐;陈静;王苗利;徐鸿;王贵升【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022【正文语种】中文【中图分类】S852.61大肠杆菌(Escherichia coli)，又被称为大肠埃希氏菌，是肠杆菌科、埃希氏菌属的代表菌 [1]。

致病性大肠杆菌给山东省畜牧业带来了一定危害，以水貂养殖为例，水貂大肠杆菌病以断乳前后的仔貂发生最多，潜伏期2～5 d，一旦发病，短时间内即可导致病貂死亡，该病的爆发和流行，严重威胁我国养貂业的发展[2]。

为了防治水貂大肠杆菌病，抗生素类药物的长期、不合理的使用导致耐药菌株不断出现，并呈现出高水平耐药、多重耐药和交叉耐药的严重发展态势[3]。

血脑屏障是在脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间存在的一个调节界面，血脑屏障不单纯是被动保护性屏障，还可以选择性的将脑内有害或过剩物质泵出脑外，保持脑的内环境恒定[4]。

目前，水貂脑组织中分离得到的大肠杆菌的耐药情况还不清楚，本文从耐药性等方面探究穿过血脑屏障的大肠杆菌的相关生物学特性。

一株貂源绿脓杆菌的分离和鉴定
杨朋欣;丁国杰;刘可姝;张春媛;王彬
【期刊名称】《中国动物保健》
【年(卷),期】2016(18)9
【摘要】为鉴定一株引起水貂发病的致病菌,本研究从患病水貂肺脏中分离获得一株优势菌,分别对该分离株进行形态、生化和培养特性研究;分子生物学和血清型鉴定;半数致死量测定.结果表明,该分离株为血清G型水貂源绿脓杆菌;分离株16S rRNA基因序列与已知的绿脓杆菌相应序列同源性为99.16%;分离菌对小鼠的半数致死量(LD50)为1.17×106CFU,对水貂的LD50为1.5×108CFU.
【总页数】3页(P75-77)
【作者】杨朋欣;丁国杰;刘可姝;张春媛;王彬
【作者单位】哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069
【正文语种】中文
【相关文献】
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绿脓杆菌检测的方法及注意事项发表时间：2020-06-12T16:07:53.667Z 来源：《健康世界》2020年8期作者：母永贵[导读] 绿脓杆菌又被称为铜绿假单胞菌，是一种革兰氏阴性菌，形状呈长方形，喜好氧气，只进行单向的运动。

绿脓杆菌又被称为铜绿假单胞菌，是一种革兰氏阴性菌，形状呈长方形，喜好氧气，只进行单向的运动。

绿脓杆菌是一种机会性感染细菌，对植物也具有机会性感染，因为被感染后渗出液呈绿色，因此而命名。

绿脓杆菌在大自然中广泛分布，是临床上比较常见的条件致病菌之一。

正常人的肠道、皮肤以及呼吸道中也存在绿脓杆菌。

绿脓杆菌分解蛋白质的能力较强且能产生多种与毒力有关的物质，例如：胰肽酶、外毒素a、胶原酶等等。

人体的任何部位及组织都可能发生绿脓杆菌感染。

常见感染部位有呼吸道、角膜、尿道。

绿脓杆菌会使人体免疫受损，虽然并不常见，但绿脓杆菌可能会造成肺炎，若隐形眼镜清洁不当也有机会引起眼角膜绿脓杆菌感染。

那么这种细菌该如何检测呢：下面我们一起来了解绿脓杆菌的检测以及注意事项。

一、绿脓杆菌检测方法由于绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌，它的实验特征为产生绿色色素和氧化酶，因此利用这一特征可以采取选择性培养基进行培养。

然后进行生化实验和菌体检验，检测的主要设备和材料为显微镜及恒温培养箱，选择的培养基和试剂为NAC琼脂平皿、NAC液体培养基糖发酵培养基、尿素培养基、营养明胶、氧化酶试剂等。

检测程序如下：首先制作培养液，将样液放入培养基中，室温控制在37℃静置24小时。

将已经接种的NAC液体培养基放置在恒温37摄氏度的培养箱中培养24小时，然后观察其生长情况。

将并未产生绿色色素的样本转种于NAC琼脂平皿?，同样在37度恒温的环境下培养24小时。

绿脓杆菌在NAC液体培养基中会呈现出均匀浑浊状态，并带有菌膜，大部分菌株能够在培养液上半部分形成绿色色素，在NAC琼脂平皿上会形成边缘不齐且扁平的锯齿状菌落，菌落的直径为2~3毫米。

第1篇一、实验目的1. 学习细菌分离纯化的基本方法。

2. 掌握绿脓杆菌的形态特征。

3. 熟悉绿脓杆菌的生化特性。

二、实验原理绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界、土壤、水和植物表面。

它是一种条件致病菌，可引起人类和动物的多种感染，如肺炎、尿路感染、烧伤感染等。

本实验通过分离纯化绿脓杆菌，观察其形态特征，进行生化实验，以鉴定绿脓杆菌。

三、实验材料与仪器1. 实验材料（1）样品：土壤、水体、植物表面等。

（2）培养基：营养肉汤、营养琼脂、伊红美蓝琼脂、葡萄糖发酵管等。

（3）试剂：无菌生理盐水、无菌接种环、无菌移液器、无菌棉签等。

2. 实验仪器（1）显微镜（2）恒温培养箱（3）高压蒸汽灭菌器（4）无菌操作台四、实验方法1. 绿脓杆菌的分离（1）将土壤、水体、植物表面等样品采集后，用无菌生理盐水进行稀释。

（2）取适量稀释液接种于营养琼脂平板，进行涂布培养。

（3）将培养皿放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

2. 绿脓杆菌的形态特征观察（1）观察菌落特征：菌落呈绿色，表面光滑、湿润，边缘整齐。

（2）显微镜观察：取少量菌落涂片，进行革兰氏染色，观察细菌形态。

3. 绿脓杆菌的生化实验（1）葡萄糖发酵实验：将适量菌液接种于葡萄糖发酵管，观察是否有气泡产生。

（2）伊红美蓝琼脂实验：将适量菌液接种于伊红美蓝琼脂平板，观察菌落颜色变化。

五、实验结果与分析1. 绿脓杆菌的分离在营养琼脂平板上，观察到绿色菌落生长，经涂布培养后，菌落形态一致，表明已分离得到绿脓杆菌。

2. 绿脓杆菌的形态特征观察（1）菌落特征：菌落呈绿色，表面光滑、湿润，边缘整齐。

（2）革兰氏染色：细菌呈革兰氏阴性，呈长棒形，两端钝圆。

3. 绿脓杆菌的生化实验（1）葡萄糖发酵实验：接种后，发酵管内产生气泡，表明绿脓杆菌能发酵葡萄糖。

（2）伊红美蓝琼脂实验：接种后，菌落呈黑色，周围有绿色晕圈，表明绿脓杆菌具有氧化酶活性。

中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第1期Chinese Journal of Veterinary Medicine秦皇岛地区貂源大肠杆菌(E .coli )的分离鉴定及药敏试验分析肖丽荣1,周㊀琦1,李巧玲1,张艳英1,张召兴1,2,贾青辉1,史秋梅1(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北秦皇岛066604;2.河北旅游职业学院畜牧兽医系,河北承德067000)㊀㊀摘要:为了确定秦皇岛地区貂源大肠杆菌(E .coli )流行情况及耐药性㊂本试验从秦皇岛地区不同水貂养殖场采集腹泻水貂的肠内容物及粪便57份,通过细菌的分离培养,形态学观察㊁生化鉴定等方法,分离鉴定出42株E .coli ㊂致病性试验表明,34株为致病性E .coli ㊂药敏试验结果表明,该菌仅对头孢克肟㊁头孢曲松㊁氟苯尼考等4种药物高度敏感;该菌具有很强的耐药性,耐药率达到40.4%~100%;该菌存在多重耐药现象,最高耐15种药物,且均耐8种药物以上㊂本研究为该地区水貂大肠杆菌病防治提供研究基础㊂关键词:水貂;大肠杆菌;分离鉴定;药敏试验;耐药性中图分类号:R378.2+1㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)01010603㊀㊀Isolation and identification of E .coli from mink and analysis ofdrug sensitivity in Qinhuangdao areaXIAO Li-rong 1,ZHOU Qi 1,LI Qiao-ling 1,ZHANG Yan-ying 1,ZHANG Zhao-xing 1,2,JIA Qing-hui 1,SHI Qiu-mei 1(1.Key Laboratorry of preventive Veterinary Medicine in Heibei Province ,Hebei Normal University of Science and Technology ,Qinhuangdao 066604,China ;2.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine ,Hebei Tourism Vocational College ,Chengde 067000,China)Abstract :In order to determine the prevalence and drug resistance of E .coli in Qinhuangdao area.57enteric contents and 57faeces of mink were collected from different mink farms in Qinhuangdao.Facrty -two strains of E.coli were identified by isolation and bacteria culture,morphological observation,biochemical identification and other methods.The pathogenicity test showed that 34strains were pathogenic E.coli .The results of drug sensitivity test showed that the bacteria were only highly sensitive to 4drugs such as cefkoxime,ceftriaxone and florfenicol.The bacteria had strong resistance and the resistance rate reached 40.4%-100%.The bac-teria were resistant to multiple drugs with an average to 8kinds of drugs,and the highest tolerance was to 15drugs.This study willprovide a basis for the prevention and treatment of mink colibacillosis in this area.Key words :Mink ;Escherichia coli ;isolation and identification ;drug sensitivity test ;drug resistanceCorresponding authors :SHI Qiu-mei ;JIA Qing-hui ;ZHANG Zhao-xing收稿日期:20180411基金项目:河北省科技厅项目(18246629G);河北省科技厅科技支撑计划(16236605D -3);石家庄市科技局项目(171500953A);河北省教育厅项目(ZD2017234);秦皇岛市科技局项目(201602A046)作者简介:肖丽荣(1995),女,硕士生,研究方向为动物病原微生物与传染病,E-mail:xlr918914@通讯作者:史秋梅,E-mail:shiqiumei@;贾青辉,E-mail:qinghuijia@;张召兴,E-mail:keshiyjszzx0224@㊀㊀水貂大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起水貂一种常见的肠道传染病,该菌可以感染各个年龄段的水貂,尤其是40~60日龄的幼貂最易感,临床上主要表现急性败血型㊁腹泻㊁痉挛㊁神经症状等,发病率和死亡率均较高,给水貂养殖业造成严重的经济损失[1]㊂大肠杆菌(E .coli )是一种存在环境中条件致病菌,血清型复杂,该菌引起多种动物及人发病,造成严重的局部或全身性感染[2]㊂2012年史秋梅等[3]报道了引起水貂严重腹泻的E .coli 血清型为O 78㊁O 38㊁O 29具有很强的致病性㊂E .coli 引起不同日龄水貂腹泻㊁肠炎,甚至呈急性死亡[4]㊂E .coli 易产生耐药性,由于在养殖水貂的过程中大量不合理使用抗菌药物,导致E .coli 耐药菌株不断出现,许多敏感药物变为耐药,其耐药谱不断增大,导致动物体内大量的抗菌药物残留,从而形成药物恶性循环[5]㊂本试验对秦皇岛地区不同养殖场腹泻水貂601Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第1期的肠内容物及粪便,利用细菌常规的方法,分离鉴定出42株致病性E.coli,进行药敏试验分析,结果表明,该地区水貂E.coli的具有很强耐药性,为该地区水貂源E.coli防控提供依据㊂1㊀材料1.1㊀病料来源㊀秦皇岛地区不同水貂养殖场采集腹泻水貂的肠内容物及粪便等进行分离培养㊂1.2㊀主要试剂㊀药敏纸片㊁微量发酵管由北京天坛药物生物技术开发公司生产;伊红美蓝培养基㊁普通营养琼脂培养基㊁麦康凯培养基由青岛高科园海博生物技术有限公司生产;ID32E肠道菌鉴定试剂条由法国梅里埃公司生产;常规仪器与试剂均由本实验室提供㊂1.3㊀实验动物㊀体重22g左右健康昆明系小鼠180只,购自于北京维通利华实验动物有限公司㊂2㊀试验方法2.1㊀细菌分离纯化㊀采集腹泻水貂的肠内容物及粪便处理后划线接种于麦康凯琼脂培养基37ħ恒温培养12~24h,挑取优势菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基进行培养,并在在普通琼脂培养基进行纯化培养㊂2.2㊀细菌形态特征㊀无菌挑取通过伊红美蓝琼脂培养基及普通琼脂培养基进行纯化培养后菌落,经革兰染色镜检㊂2.3㊀细菌生化特性鉴定㊀利用ID32E肠道菌鉴定试剂条及微量发酵管,按说明书进行操作,用ATB 全自动生化鉴定系统进行生化试验鉴定㊂2.4㊀致病性试验㊀试验组每株菌攻毒4只小鼠,剂量按0.2mL/只,腹腔注射(5ˑ108CFU/mL),对照组4只小鼠注射等量的营养肉汤㊂观察发病及死亡情况,剖检小鼠对其肝㊁肺等组织进行分离鉴定㊂2.5㊀药敏试验㊀按照K-B纸片法进行试验操作和结果判断[6]㊂取分离纯化的分离菌接种营养肉汤, 37ħ震荡培养12h~15h,使菌液浓度调整至0.5号麦氏标准管浊度,涂抹于琼脂平板,贴上药敏片,置37ħ培养16h~18h,测定抑菌圈直径㊂美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准3㊀结果分析3.1㊀细菌分离纯化与形态观察㊀分离菌在麦康凯琼脂培养基上长出呈粉红色㊁边缘光滑整齐㊁湿润的扁圆的菌落;伊红美蓝培养基上长出深紫黑色㊁带金属光泽的圆形菌落㊂在普通琼脂平板上长出白色㊁光滑湿润的菌落㊂革兰染色镜检,分离菌为革兰阴性菌,两端钝圆,短小杆状菌㊂3.2㊀生化试验结果㊀该42株分离菌株吲哚试验为阳性㊁V-P试验为阴性,均能产酸不产气,不分解尿素,发酵甘露醇㊁葡萄糖㊁海藻糖㊁麦芽糖㊁阿拉伯糖㊁鼠李糖等㊂用ATB全自动生化鉴定系统进行检测分析,鉴定结果为均E.coli,评定结果合格率为99.3%㊂3.3㊀致病性试验㊀试验组小鼠24~48h左右发病死亡,进行剖检和细菌分离培养鉴定㊂结果显示,从死亡的小鼠体内分离的菌与该菌一致㊂对照组4只小鼠健康存活,表明该分离菌株有一定致病性㊂3.4㊀药敏试验结果与多重耐药分析㊀由表1药敏试验结果可见,34株水貂源致病性E.coli对头孢克肟㊁氟苯尼考㊁阿米考星等高度敏感;对新霉素㊁氨苄西林㊁红霉素等中度敏感;其中复方新诺明㊁阿莫西林㊁四环素㊁耐药率最高达100%,磺胺间甲氧异恶唑耐药率87.7%,其他药物耐药率为40.4%~ 75.0%之间根据药敏结果,由表1和表2可以看出,该地区的水貂源致病性E.coli呈多重耐药㊂其中耐13种药物的菌株数最多达12株,耐15种药物的细菌有2株,耐14种药物的细菌有3株,耐12种药物的有7株,耐10种药物的有5株,耐9种药物的有2株,耐8种药物的有3株㊂4㊀讨论秦皇岛地区不同养殖场腹泻水貂的肠内容物及粪便中分离鉴定出42株致病性E.coli,从形态学观察㊁培养特性分析㊁生化鉴定等方面特性与‘伯杰细菌鉴定手册“报道一致㊂通过人工感染试验小鼠,试验组小鼠发病死亡,对照组4只小鼠健康存活,从死亡的小鼠体内分离的菌与该菌一致㊂证实该菌有一定致病性㊂E.coli是引起不同日龄水貂腹泻的主要病原菌㊂相关报道了2011-2013年间山东10个不同水貂养殖场E.coli感染率为14.04%[7]㊂潘德芹等[8]报道山东地区241份水貂病料中检出致病性E.coli占11.2%㊂该菌对我国水貂养殖造成很大的危害㊂本试验对其秦皇岛地区分离的34株水貂源致病性E.coli对常用的18种抗菌药物进行了药敏试验,分析其耐药性㊂药敏试验结果显示,34株致病性E.coli仅头孢克肟㊁氟苯尼考㊁阿米考星等4种药物701中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第1期Chinese Journal of Veterinary Medicine 表1㊀34株貉源大肠杆菌对18种抗生素的耐药结果(n=34)抗菌药物抑菌圈直径/mm34株菌耐药率R I S R/%I/%S/%四环素类强力霉素ɤ1011~17>1876.423.50四环素ɤ1314~19>2010000氨基糖苷类庆大霉素ɤ1011~20>2175.025.00阿米卡星ɤ1213~17>1862.5 6.3031.2新霉素ɤ1011~20>2152.947.10链霉素ɤ1011~20>2165.734.30β-内酰胺类阿莫西林ɤ1011~20>2110000氨苄西林ɤ1011~18>1952.947.10头孢克肟ɤ1011~20>2122.722.350头孢曲松ɤ1011~19>2062.5 6.3031.2大环内酯类红霉素ɤ1011~20>2162.537.50氯霉素类氟苯尼考ɤ1011~19>2040.425.434.2喹诺酮类恩诺沙星ɤ1011~19>2068.431.60环丙沙星ɤ1011~19>2063.436.60左氧氟沙星ɤ1011~19>2069.431.210..3磺胺类复方新诺明ɤ1011~20>2110000磺胺间甲氧异恶唑ɤ1112~18>1987.712.30多肽类多黏菌素ɤ1011~20>2162.637.40S:高度敏感;I:中度敏感;R:耐药表2㊀34株貉源E.coli的多重耐药分析含耐药种数菌株数15214313121271059283高度敏感;对阿莫西林㊁四环素等4种药物耐药率达100%,该地区的水貂感染的E.coli具有很强的耐药性㊂与于杰等[9]报道的水貂源E.coli对氟喹诺酮类药物产生强的耐药性基本上一致㊂史秋梅等[3]报道了对腹泻水貂进行了药敏分析,对恩诺沙星㊁环丙沙星㊁庆大霉素敏感,与本试验药敏结果存在一定的差异性,可能与该菌携带的耐药基因有关㊂通过药敏试验分析表明,该地区的水貂源致病性E-.coli呈多重耐药性,且耐药菌在8种药物以上㊂孙蓉蓉等[10]报道,青岛地区10株貂源E.coli对18种抗生素不同程度的耐药,对氨苄西林㊁链霉素等耐药性大于50%,并且呈现多重耐药,其中2个菌株同时耐9种药,2个菌株同时耐4种药等㊂地域不同,其该菌的耐药性存在一定的差异,根据该菌易流行及易产生耐药特点,对其该菌进行药敏试验,分析其该菌耐药性,合理使用抗生素,降低该菌耐药性,才能起到良好的防治效果㊂参考文献:[1]㊀夏琦琦,温珊珊,马斯琪,等.水貂源致病性大肠杆菌生物被膜形成能力㊁耐药性及毒力岛基因检测与分析[J].中国预防兽医学报,2017,39(05):361-365.[2]㊀陈薄言.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2006:112118.[3]㊀史秋梅,张艳英,房海,等.腹泻的水貉携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌[J].中国兽医学报,2012,32(6):857861. 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