第五讲__酶的分子修饰

⑥利用蛋白质状态的差异：
有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。 核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在第 119号组氨酸上，对第12号组氨酸修饰很少，两者之比为60：1； 但在水溶液中进行同样的修饰，两者之比为15：1。
4、修饰程度和修饰部位的测定
(1)分析方法：
光谱法：要求修饰后的衍生物具有独特的光谱或它的光谱 与修饰剂的不同； 间接法：同位素标记、有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振 谱、荧光标记。
2、修饰剂的反应性
1、影响酶蛋白功能基团的反应性因素
①微区的极性 ②基团间的氢键 ③静电效应 ④位阻效应 ⑤其它
电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度
①微区的极性
微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。 极性对整个反应速度影响与反应的类型有密切关系。 从整体看来，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸 和胱氨酸反应性的影响较小 对氨基和组氨酸反应性的影响较大 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大
①反应体系中酶与修饰剂的分子比例 ②反应体系中的溶剂性质、盐浓度和pH条件 ③反应温度及时间
（3）对酶反应条件的选择：
5.2、酶分子的修饰方法
物理修饰：
不改变酶的组成单位及其基团的修饰，即酶分子中的 共价键不发生改变，只是在物理因素（高温、高压、 高盐、极端pH值）作用下，副键发生某些变化和重排。
蛋白质的空间结构和试剂的空间结构之间的相互 影响也能加强修饰反应速度和反应的专一性。 对核糖核酸酶A第119号组氨酸和第l2号组氨酸的 修饰，使用不同的试剂，这两个残基的反应速度 就不同。 烷基化反应在第l2号组氨酸；羧甲基化 反应选择性修饰第119号组氨酸。 一般来说，试剂的体积小一些为宜，这样既能保 证修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破 坏蛋白质分子严密结构的危险。
②基团间的氢键作用
在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pKa应比正 常值低，而酚基的pKa高于正常值。
OH COOH
O
H
+ +H 1/2O
C
O 1/2-
③静电效应
用高分辨率的核磁共振组氨酸残基的电离行为 进行研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的 pKa是不同的；
原因可能在于带电基团相互静电作用的影响。
①酶的分离纯化：
首先将欲进行修饰酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液；
②除去原有金属离子：
加入一定量的金属螯合剂（如乙二胺四乙酸（EDTA）等）使酶分子中的金 属离子与螯合剂形成螯合物，通过透析、超滤、分子筛层析等方法将金属螯合 物从酶液中除去，酶往往成为无活性状态；
③加入置换离子：
在去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属 离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。
④催化因素
修饰部位的其他功能基，如果是产生一般的酸碱催 化作用，则也能影响修饰反应。不同的修饰剂，其 反应速度和反应部位有明显差异。 对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐对胰凝乳蛋白酶的活性 丝氨酸的乙酰化属于同一机理，但苯乙酸盐的反应 性差，这在较大程度上与酶的酸碱催化有关。 氟磷酸盐与氯磷酸盐相比，对丝氨酸酶有非常高的 反应性，这可能与一般酸碱催化除去氟原子有关。
(3)反应的专一性
①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性：
二异丙基氟磷酸酯(DEP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸 作用迅速导致酶失活，但DEP在同样条件下却不能与胰凝 乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用；
②选择不同的反应pH值：
蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。如用 溴(碘)代乙酸(或其酰胺)对蛋白质进行修饰时：
选择吸附 静电相互作用 位阻因素 催化因素
①选择吸附
化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点选择性地 吸附在低极性区或高极性区，有时可以根据对速 度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形 成。 正像酶-底物复合物那样，蛋白质修饰剂复合物形 成后，修饰过程的速度就加强了，这种速度的加 强，部分是由于选择性吸附的结果。
(2)化学修饰数据的分析：
时间进程分析获得时间进程曲线，可以了解修饰残基的性 质和数目以及修饰残基与蛋白质生物活性之间的关系等； 确定必需基团的性质和数目：邹氏作图法（1962年邹承鲁）
二、酶分子的化学修饰
1、金属离子置换修饰 2、大分子结合修饰(共价/非共价) 3、侧链基团修饰 4、肽链有限水解修饰 5、氨基酸置换修饰
3、修饰反应专一性的控制 (1)试剂的选择 (2)反应条件的选择 (3)反应的专一性
(1)试剂的选择

一般来说，选择蛋白质修饰剂要考虑以下问题： 修饰反应要完成到什么程度 对个别氨基酸是否专一 在反应条件下，修饰反应有没有限度 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变 是否需要分离修饰后的衍生物 反应是否可逆 是否适合于建立快速、方便的分析方法
胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原
可逆共价调节
磷酸化酶a与磷酸化酶b互变
2、酶分子修饰的意义
增强酶的稳定性（stability）
提高酶的活力（activity）
降低或消除酶的抗原性（immunological property）
研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子 和各种物理因素对酶分子空间构象（structure）的影响
★当反应pH值为6时，只专一与组氨酸的咪唑基作用； ★当反应pH值为3时，则专一与甲硫氨酸侧链作用。
反应的专一性
③利用某些产物的不稳定性：
在高pH值下，用二硫化碳、O一甲基异脲和亚氨酸等可将氨 基转变成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用， 但因pH值高，与巯基形成的产物可被迅速分解。
④亲和标记：
化学修饰： ★广义:指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的
转变。 ★狭义:指在较温和的条件下以可控的方式使一种蛋白质 与某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残 基或其功能基团发生共价的化学变化。
一、影响酶分子化学修饰的主要因素 1、酶蛋白功能基团的反应性
蛋白质功能基团所处的环境会强烈地影响它的物理和 化学性质 蛋白质分子的表面特点也影响化学试剂的接近 因此，有必要考察局部衡区对功能基和修饰剂的影响。 由于功能基的反应性是通过它的亲核性来测量的，应 当强调pKa和影响pKa的因素。
★旋转自由度
加快修饰反应速度的一个重要原因是限制了构象 的总数(即限制了旋转自由度)，这种限制可能是 由于上述提及的几类相互作用引起的。
酚酸的酯化速度：在苯环上引入几个甲基，特
别是在同一碳原子上引入2个甲基，则限制了基团 的自由旋转，因而使酚酸的酯化速度常数提高了 108倍以上。
2、影响修饰剂反应性的因素
④位阻效应
烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能 基接触，出现位阻效应。 对枯草杆菌蛋白酶BPN的X射线衍射研究指出：10个 酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。对它进行彻底 硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被修饰。若 没有X射线衍射研究结果，很可能解释为至少有2个 酪氨酸残基被包埋在分子内部，但实际情况并不是 这样的，这种情况很可能是空间障碍引起的。
1、金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，
使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。
α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+） 谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)
过氧化氢酶分子中的亚铁离子(Fe2+)
酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+） 超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)
化学修饰的原理与特点
第五讲
酶分子修饰
5.1、酶分子修饰的定义及其意义
5.2、酶分子修饰方法
5.3、酶修饰后的性质变化 5.4、酶的分子定向进化
分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因？

热稳定性差 活力低 耐受pH范围窄 分子量过大 成本高 来源有限 有异体反应
第五讲
酶分子修饰
讲课：阳 飞 系部：生化系
作业
第五讲 酶分子修饰
教学目标：
了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用 理解蛋白酶化学修饰的方法和意义 掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点
教学重点：
酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式
教学难点：
(2)反应条件的选择
蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许能顺利进 行外，还必须满足以下要求： 一是不造成蛋白质的不可逆变性（做对照实验）； 二是有利于专一性修饰蛋白质（反应的温度、pH、反应介 质、缓冲液）。 氯离子能够抑制碳酸酐酶的酯酶活力，所以修饰反应缓冲 液中不能含有氯离子； 磷酸盐是某些酶的竞争抑制剂，该离子的结合可能会封闭 修饰部位； 钙离子对α-淀粉酶的激活作用。
在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白 质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用，然后将过量 的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位 素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的 基团是带放射性同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质 发挥功能作用的必需基团；
酶的金属离子置换修饰
பைடு நூலகம்从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧
失其催化活性。 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以 恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不 同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有 的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
★金属离子置换修饰的过程：
5.1、酶分子修饰的定义及其意义
1、定义：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。