如何鉴别显微镜的分辨率

光学显微镜中的分辨率与成像原理光学显微镜是一种常用的科学仪器，它能够让我们观察到微观世界中微小的细胞、组织甚至分子层面的细节。

然而，我们或许并没有意识到，显微镜的分辨率和成像原理是如何影响我们所看到的图像的。

本文将探讨光学显微镜中的分辨率与成像原理的相关知识。

要理解显微镜的分辨率，我们首先需要了解一些基本原理。

在光学显微镜中，光通过透镜系统后，会在焦平面上产生一个聚焦后的图像，也就是我们在目镜中看到的物体。

但是，由于光的折射和衍射现象，导致图像的细节受到了一定的限制，即我们常说的分辨率。

光的折射是指当光从一种介质进入到另一种介质时，会改变其传播方向。

这就意味着当光通过透镜系统中的透镜时，由于光的折射现象，会导致图像发生畸变。

这种畸变也会影响到我们观察到的图像质量和分辨率。

光的衍射则是指光通过一个或多个孔径或障碍物时，会沿着波的传播方向发生弯曲和扩散。

这就意味着当光通过显微镜中的孔径、物镜和目镜等光学元件时，会发生衍射现象，造成图像的模糊和细节的损失。

衍射现象是限制光学显微镜分辨率的主要因素之一。

折射和衍射是光学系统中不可避免的物理现象，也是显微镜图像分辨率的主要限制因素。

为了解决这个问题，科学家们通过改进光学系统的设计和制造工艺，提高了显微镜的分辨率。

其中一个重要的突破是发展了折射率更高的透镜材料，如高倍率的近视眼玻璃，使得图像的畸变减少。

另一个突破是使用更小的孔径和更低的光波长，以减小衍射现象的影响，从而提高分辨率。

然而，即使有了这些技术改进，显微镜的分辨率也存在一定的限制。

这是由于分辨率的极限取决于光的波长和孔径的大小。

根据衍射理论，分辨率可以通过以下公式计算：分辨率= 0.61 * λ / NA，其中λ是光的波长，NA是数值孔径。

这个公式告诉我们，当光的波长越小和数值孔径越大时，分辨率就会越高。

因此，要想获得更高的显微镜分辨率，就需要使用更高分辨率的目镜和物镜，并选择适当的光波长。

总结起来，光学显微镜中的分辨率与成像原理密切相关。

显微镜光学参数
显微镜的光学参数包括以下几个方面：
1. 放大倍率（Magnification）：显微镜放大倍率是指显微镜看
物体时的放大倍数。

它可以分为目镜放大倍率和物镜放大倍率。

目镜放大倍率是指目镜的放大倍数，物镜放大倍率是指物镜的放大倍数。

总放大倍率等于目镜放大倍率乘以物镜放大倍率。

2. 分辨率（Resolution）：显微镜的分辨率代表了显微镜能够
将两个紧邻的物体区分开的能力。

分辨率取决于显微镜的光学性能和光的波长。

分辨率越高，可以看到的更小的细节。

3. 工作距离（Working distance）：显微镜的工作距离是指显
微镜物镜与被观察物体之间的距离。

较大的工作距离可以提供更大的操作空间，便于操作。

但工作距离越大，图像质量可能会受到影响。

4. 孔径（Aperture）：显微镜的孔径是指物镜的开口大小，它
决定了所接收光线的数量和角度。

较大的孔径可以提供更高的光通量和更高的分辨率。

然而，较大的孔径也可能导致深度对焦的问题。

5. 深景深（Depth of field）：显微镜的景深是指物镜在特定放
大倍率下所能保持清晰焦点的范围。

较大的景深意味着更多的图像在焦平面上保持清晰，但也可能导致图像的分辨率降低。

这些光学参数是显微镜的重要指标，可以根据具体应用需求选择合适的显微镜。

引言概述：显微镜是一种用于观察微小物体的光学设备，它通过放大被观察物体的图像，使我们能够看到肉眼无法察觉到的微小细节。

在科学研究、医学诊断以及工业制造等领域中，显微镜都扮演着重要的角色。

本文将对显微镜的相关知识点进行梳理，包括显微镜的原理、分类、主要组成部分、应用以及日常维护等方面。

正文内容：一、显微镜的原理1. 光学放大原理：显微镜利用透镜或物镜将光线聚焦到焦点上，然后利用目镜放大焦点上的光线，从而实现对样品的放大观察。

2. 分辨率原理：分辨率是指显微镜能够分辨的最小距离。

它受到物镜数值孔径、波长以及眼睛的分辨能力等因素的影响。

3. 像差原理：显微镜在设计和制造过程中需要考虑多种像差，如球差、色差、像散等，以提高成像质量。

二、显微镜的分类1. 光学显微镜：光学显微镜是使用可见光进行观察的一种显微镜，分为单镜显微镜和复合显微镜两种类型。

2. 电子显微镜：电子显微镜利用电子束代替光线，以提高分辨率和放大倍数。

包括透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种类型。

3. 荧光显微镜：荧光显微镜利用荧光染料标记样品，通过激发荧光的方式观察样品的细胞结构和功能。

4. 原子力显微镜：原子力显微镜利用微型探针来感知样品的表面，能够达到原子尺度的分辨率。

5. 红外显微镜：红外显微镜利用红外辐射来观察样品的分子结构和化学成分。

三、显微镜的主要组成部分1. 物镜：物镜是显微镜的一个重要组成部分，它负责在样品上产生放大的像。

2. 目镜：目镜位于显微镜的顶部，负责放大物镜产生的像，并将其投影到人眼中。

3. 照明系统：照明系统包括光源、聚光透镜和光阑等部分，用于照亮样品并提供足够的光线。

4. 操作系统：操作系统包括对焦调节、缩放调节等功能，以便用户能够观察到所需的细小结构。

5. 支撑结构：支撑结构包括显微镜的支架、台座和臂等部分，需要稳定支撑显微镜的各个组件。

四、显微镜的应用1. 生物学研究：显微镜在生物学研究中扮演着重要角色，可以观察细胞结构、细菌、微生物以及生物分子等。

显微镜分辨率：概念、因素和计算在显微镜学中，‘分辨率’一词用于阐述显微镜对细节进行区分的能力。

换言之，这是样本内两个能被观察人员或者显微镜摄像头区分的实体点之间的理想的距离。

显微镜的分辨率本质上与光学元件的数值孔径（NA）以及用于观察样本标本的光波长有关。

此外，我们必须考虑Ernst Abbe于1873年首次提出的衍射极限。

本文章包含了这些概念的历史介绍并使用相对简单的术语对其进行了解释。

分辨率与数值孔径数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n ×sin α）。

显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。

在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。

分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。

在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。

以下按时间顺序逐一介绍。

George Biddell Airy与‘艾里斑’（1835）George Biddell Airy（1801-1892）是英国数学家和天文学家。

1826年，25岁的他被任命为三一学院的数学教授，两年后，被任命为新剑桥天文台的天文学教授。

1835年到1881年期间，他是“皇家天文学家”，月球和火星上各有一处以他的名字命名的陨石坑。

1835年，他在剑桥哲学学会学报上发表了一篇题为《有关圆孔径物镜的衍射》的论文。

Airy在论文中以一个天文学家的视角描述了通过一个精良的望远镜观察到的恒星周围的光环或者射线的形状及亮度。

尽管是从不同的科学领域发表的文章，但这些观察结果与其他光学系统，特别是显微镜存在着关联。

艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系统中由圆形孔径形成的聚焦的光点。

如图1所示，其呈现为中央亮点和周围是明暗相间的同心环（更准确地说，这是艾里图案Airy pattern）。

核心提示：显微镜光学系统的主要构件是显微镜物镜和目镜,其任务是放大,并获得清晰的图像，市场上显微镜物镜种类很多，究竟如何判断物镜的优劣？首先，我们先来认识下物镜。

一.物镜的类型显微镜物镜的优劣直接影响显微镜成象的质量,这与象差的校正有关,因此,物镜是根据象差校正的程度分类的.在第一透镜成象的象差分晰中已知:对映象质量影响最大的是球面差、色差和象场弯曲，前二项对映象中央部分的清晰度有很大影响，而弯场弯曲对摄影边缘部分有极大影响。

这里，就常用的几种物镜特性说明如下。

●消色差及平面消色差物镜这两种物镜球差色差的校仅为黄、绿、二个波区，仍然存在其他波区的球差和色差，因而映象不有得到各色彩间的真实关系，当焦点变动时可以看到残余的色差。

但一般低倍放大时影响不大。

鉴于其黄绿波区校正较佳，使用时宜以黄绿光作为照明光源，或在入色、红色滤光片，以免显著暴露未校正的色差。

消色左物镜常与福根目镜或校正目镜相配合，用于低倍、中倍放大。

因其结构较为简单，映象中央部分象差大致可以校正，价格又低，故应用较多。

一般台式显微镜物镜多属此类。

平面消色差物镜对象场弯曲作了进一步校正，因此投象平直，使视域边缘与中心能同时清晰成象。

所以适于金相显微镜摄影。

●复消色差物镜及平面复消色差物镜复消色差物镜是由多组透镜组合而成的。

色差的校正实际上等于可风光的全部波区，但部分放大率色差仍然存在。

当其与福根目镜或其它简单组合目镜配用时，这些残存的色差会使映像边缘略带色彩。

因此，需要与补偿型目镜配合使用。

复消色差物镜对于光源无任何限制，白光照明也可得到良好的效果。

若加入蓝色或黄色滤光片效果更佳。

它是显微镜中最优良的一种物镜。

平面消色差物镜除进一步作象弯曲的校正外，其它象差校正程度与复消色物镜相同。

使用复消色差物镜造象的平坦程度不如消色差物镜，而平面复消色段物镜可使映象清晰、平坦、进一步提高成象质量。

●半复消色差物镜显微镜就象差校正程度而言，半复消色差物镜介于消色差与复消色差物镜之间，但其它光学性质都与复消色差物镜接近。

光学显微镜的评价标准与性能优化研究光学显微镜是一种基本的科学仪器，广泛应用于生物学、医学、材料科学等众多领域随着科学技术的不断发展，光学显微镜的性能也在不断提高，但如何评价光学显微镜的性能以及如何对其进行性能优化成为了一个重要的研究课题本文将围绕光学显微镜的评价标准与性能优化展开讨论1. 光学显微镜的评价标准光学显微镜的性能评价主要从以下几个方面进行：1.1 分辨率分辨率是评价光学显微镜性能的重要指标，它指的是显微镜能够分辨开两个相邻物点的能力分辨率越高，显微镜所能观察到的细节就越清晰常见的分辨率评价方法有阿贝数、数值孔径等1.2 放大倍数放大倍数是衡量显微镜观察范围的重要指标，它表示显微镜将样本放大的程度放大倍数越高，观察到的样本细节就越清晰但是，放大倍数过高也会导致视场角减小，观察范围受限1.3 景深景深是指在显微镜下，能够保持清晰成像的样本厚度景深越大，样本的立体感就越强影响景深的因素有镜头的数值孔径、光源的亮度等1.4 杂光和噪声杂光和噪声是影响显微镜成像质量的重要因素杂光指的是非来自样本的光线，它会降低成像的清晰度噪声则是指成像过程中的随机波动，会导致图像模糊降低杂光和噪声是提高显微镜成像质量的关键2. 性能优化方法为了提高光学显微镜的性能，可以采取以下几种优化方法：2.1 优化镜头系统选择高数值孔径的镜头，可以提高显微镜的分辨率同时，镜头的质量和制造工艺也会影响到显微镜的性能2.2 改进光源系统光源是显微镜成像的关键，合理选择光源和优化光源系统对于提高成像质量至关重要例如，使用LED光源可以提高成像的亮度和稳定性2.3 降低杂光和噪声采用光学滤波器、调整光源亮度、优化样本制备等方法可以降低杂光和噪声，提高成像质量2.4 图像处理技术通过数字图像处理技术，如去噪、锐化、对比度增强等方法，可以进一步提高显微镜成像的质量本文对光学显微镜的评价标准与性能优化进行了讨论了解评价标准，采取相应的性能优化方法，可以有效提高光学显微镜的性能，为科学研究和临床诊断提供更好的支持3. 光学显微镜的校准与维护为了确保光学显微镜的性能稳定，对其进行定期的校准和维护至关重要校准主要包括对镜头、台、光源等部件的调整，以保证成像的准确性和稳定性维护工作则包括清洁、更换磨损的部件等，以延长显微镜的使用寿命3.1 校准方法光学显微镜的校准可以通过以下几种方法进行：•干涉仪法：利用干涉仪测量镜头与物体的距离，根据干涉条纹的变化计算出镜头的焦距，从而进行校准•自动对焦法：通过自动对焦功能，调整镜头与物体的距离，使成像达到最清晰状态•标定板法：使用具有已知尺寸的标定板，通过测量成像尺寸与实际尺寸的差异，计算出需要调整的参数3.2 维护措施显微镜的维护主要包括以下几个方面：•清洁：定期清洁镜头、物镜、目镜等部件，防止灰尘和污垢影响成像质量•检查部件：检查显微镜的各个部件是否磨损或损坏，及时更换需要更换的部件•调节机构：检查显微镜的调节机构是否灵活，如转换器、焦距调节等•光源维护：定期检查光源系统，如LED光源、荧光光源等，确保其正常工作4. 光学显微镜在实际应用中的性能优化光学显微镜在不同的应用领域和实验条件下，需要针对具体的性能要求进行优化以下是一些常见的性能优化方法：4.1 生物医学领域在生物医学领域，光学显微镜常用于观察细胞、组织等生物样本为了提高成像质量，可以采取以下措施：•使用荧光染色技术，增强样本的对比度•采用高倍率镜头，提高观察的分辨率•利用共聚焦显微镜技术，获取样本的深度信息4.2 材料科学领域在材料科学领域，光学显微镜主要用于观察材料的微观结构为了提高成像质量，可以采取以下措施：•使用特殊的样品制备技术，如抛光、腐蚀等，使样本表面光滑，减少散射光•采用金相显微镜，观察金属材料的微观结构•利用偏光显微镜，观察材料的晶体结构4.3 半导体领域在半导体领域，光学显微镜常用于观察芯片的微观结构为了提高成像质量，可以采取以下措施：•使用高分辨率镜头，提高成像的分辨率•采用照明和观察角度的控制，减少反射和散射光•利用电子束扫描显微镜，观察芯片的微观结构通过针对不同应用领域的具体需求进行性能优化，可以确保光学显微镜在实际应用中发挥最佳的性能光学显微镜的评价标准与性能优化是光学显微镜研究领域的重要课题通过对显微镜的校准与维护，可以保证其性能的稳定和可靠针对不同应用领域的具体需求进行性能优化，可以进一步提高显微镜的成像质量，为科学研究和临床诊断提供更好的支持5. 光学显微镜的未来发展趋势随着科学技术的不断进步，光学显微镜的发展也呈现出一些新的趋势5.1 高分辨率和高放大倍数未来光学显微镜的发展将更加注重分辨率和高放大倍数通过采用新的光学材料、改进镜头设计等方法，进一步提高显微镜的分辨率同时，开发新的高倍率镜头，使得显微镜能够观察到更细微的结构5.2 多功能和集成化未来的光学显微镜将朝着多功能和集成化的方向发展通过将多种显微技术（如荧光显微、电子显微等）集成到一个平台上，实现多种观测方式和数据处理方法的融合，为科研工作提供更全面、更深入的观测手段5.3 智能化和自动化随着和机器学习技术的发展，未来的光学显微镜将实现智能化和自动化通过引入计算机控制系统，实现显微镜的自动对焦、自动调焦等功能，提高观测的效率和准确性5.4 在线观测和远程控制未来的光学显微镜将实现在线观测和远程控制通过互联网技术和远程控制软件，研究人员可以实时观察显微镜下的样本，并进行远程操控，打破了地理限制，提高了合作和交流的效率6. 结论光学显微镜作为一种基本的科学仪器，在众多领域发挥着重要的作用通过对其评价标准的研究和性能的优化，可以进一步提高显微镜的成像质量，为科学研究和临床诊断提供更好的支持同时，随着科学技术的不断进步，光学显微镜也将朝着更高分辨率、多功能集成、智能化自动化以及在线观测和远程控制等方向发展，为人类科学研究的深入带来更多的可能性光学显微镜的评价标准与性能优化是一个持续不断的研究领域，需要广大科研人员共同努力，不断探索和创新，以推动光学显微镜技术的发展，为人类科学的进步做出更大的贡献。

流强度而稳定束流。
当阴极采用六硼化镧（LaB6）单晶时，功函数远低于钨，电子发射率远高于钨，其尖端（见图613b）可以加工到（φ10µm～φ20µm），因而能在相同束流时可获得比钨丝更细更亮的电子束斑 光源，直径约5～10µm，可进一步提高仪器的分辨率。但LaB6的工作温度相对较低，对真空度的 要求高，且加工困难，制备成本高。
三、电镜的电子光学系统
透射电镜主要由电子光学系统、电源控制系统和真空系统三大部分组成。 电子光学系统为电镜的核心部分，包括照明、成像和观察记录三大系统组成。 1. 照明系统 主要由电子枪和聚光镜组成。 1）电子枪－电子枪就是产生稳定的电子束流的装置，电子枪发射电子形成照明 光源，根据产生电子束的原理的不同，可分为热发射型和场发射型两种。
当Mi>1时，中间镜起放大作用； 当Mi<1时，则起缩小作用。 （2）进行成像操作和衍射操作。 通过调节中间镜的励磁电流，改变中间镜的焦距，使中间镜的物平面与物镜的像平面重合，在 荧光屏上可获得清晰放大的像，即成像操作。 如果中间镜的物平面与物镜的后焦面重合，则可在荧光屏上获得电子衍射花样，即衍射操作， 3）投影镜 投影镜是成像系统中最后一个电磁透镜，强励磁短焦距，其作用是将中间镜形成的像进一步 放大，并投影到荧光屏上。 投影镜景深大，即使中间镜的像发生移动，也不会影响在荧光屏上得到清晰的图像。
（a）Airy斑
（b）两个Airy斑靠近到刚好能分辨的临界距离时强度的叠加
图5-1 两个理想物点成像时形成的Airy斑
一、光学显微镜的分辨率
对于光学显微镜，nsinα=1.2左右，n=1.5, α=70°~75° r0=1/2λ
分辨率主要决定于照明光源的波长，半波长是分辨率的理论极限. 可见光波长为390～770nm，其极限分辨率为200nm（0.2µm）左右。 人眼分辨率约为0.2mm，光学显微镜分辨率为0.2µm，因此光学显微镜的有效放大倍数约为 1000倍。 注意：光学显微镜的放大倍数可以做得更高，但高出的部分只是改善舒适度，对分辨率没有 贡献。通常为1000～1500倍。 降低光源波长，可提高显微镜的分辨率。 比可见光波长短的还有紫外线、X射线和γ射线，由于紫外线易被多数物质强烈吸收，而X、γ 射线无法折射和聚焦，它们均不能成为显微镜的照明光源。

奥林巴斯显微镜物镜的数值孔径和分辨率显微镜物镜的数值孔径是其聚集的光，并在一个固定的物体距离解决细标本细节能力的量度。

图像形成光波穿过试样和如图1所示的该锥形光的纵切片示出孔径角，是由物镜的焦距确定的值中的倒置锥体进入物镜。

角μ是二分之一的孔径角（A）和涉及通过以下公式的数值孔径：数值孔径（NA）= n(sin μ)其中n是物镜的前透镜和样品盖玻璃，即从1.00范围为空气至1.51专门浸没油一个值之间的成像介质的折射率。

许多作者用变量α为μ数值孔径公式所示。

从这个方程很明显，当成像介质为空气（具有折射率，n = 1.0），则数值孔径仅取决于角度μ的最大值为90°。

角μ的sin，因此，具有（使用“干”显微镜物镜）的1.0（sin（90°）= 1），这是用空气作为成像介质操作透镜的理论最大数值孔径的最大值。

在实践中，但是，它是很难达到0.95以上的数值孔径值与干物镜。

图2示出了一系列从变焦距和数值孔径的物镜导出的光锥。

作为锥改变光的角度为7°μ增加，如图2（a）至图2的（c）60°，在数值孔径从0.12至0.87所得的增加，接近限制时空气是成像中。

通过检查数值孔径方程，很明显，折射率是在实现数值孔径大于1.0的限制因素。

因此，为了获得更高的工作数值孔径，物镜的前透镜和试样之间的介质的折射率必须增加。

显微镜物镜现在可以允许成像另类媒介，例如水（折射率= 1.33），甘油（折射率= 1.47），和浸油（折射率= 1.51）。

护理应符合这些物镜被用于防止当一个物镜是用比它的物镜是为不同的液浸介质中使用，这将产生不希望的伪影。

我们建议显微镜从不使用专为浸油或者用甘油或水的物镜，虽然有几个新的物镜，最近出台了将与多个媒体合作。

你应该向制造商咨询是否有任何怀疑。

在60X和100X（或更高倍率）的放大倍率范围最物镜是设计用于浸油的使用。

通过检查上面的数值孔径方程，我们发现，与浸油得到的最高理论数值孔径为1.51（当sin（μ）= 1）。

物镜数值孔径与分辨率关系
数值孔径定义
数值孔径（NA）是物镜的重要参数，表示物镜收集光线的能力， 影响显微镜的分辨率和亮度。
分辨率与数值孔径关系
分辨率与数值孔径成正比，数值孔径越大，显微镜的分辨率越高。
高数值孔径物镜特点
高数值孔径物镜能够收集更多光线，提高图像亮度和清晰度，同时 能够解析更细微的结构。
位于显微镜顶部，用于放大物 镜所成的像，便于观察。
载物台
放置被观察物体的平台，可移 动以调整观察位置。
照明系统
包括光源和聚光镜等部件，提 供适当的光照条件。
分辨率概念及影响因素
分辨率定义
显微镜能够分辨的两个相邻点或线之 间的最小距离，通常以单位长度内能 够分辨的线对数来表示。
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光源波长
波长越短，分辨率越高。因此，使用 紫外光或可见光作为光源可以提高分 辨率。
提供足够亮度和均匀性的光源，确保 被观察物体清晰可见。
显微镜物镜与目镜
物镜靠近被观察物体，形成第一次放 大实像；目镜靠近眼睛，将物镜所成 的像再次放大。
显微镜主要部件及功能
物镜
靠近被观察物体的透镜组，具 有不同的放大倍数和工作距离。
调焦机构
用于调整物镜与载物台之间的 距离，使被观察物体清晰成像。
目镜
其他领域应用案例分享
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文物保护与修复
利用显微镜观察文物的微 观结构和损伤情况，为文 物保护和修复提供科学依 据和技术支持。
环境监测与治理
借助显微镜观察环境样品 中的微生物、污染物等， 为环境监测和治理提供准 确数据和有效手段。
食品安全检测
通过显微镜观察食品中的 微生物、添加剂等有害物 质，保障食品安全和消费 者健康。

显微镜分辨率
显微镜分辨率
分辨率反映的是将试样上细微组织形成清晰可辨的映象能力。
分辨率：点分辨率—表示显微镜所能分辨的两点之间的最小 距离。
线分辨率：—表示显微镜所能分辨的两条线之间的最小距离， 通常通过拍摄已知晶体的晶格像来测定，又称晶格分辨率。
信息分辨率 ：振幅衰减到37％的分辨极限标线与衰减包络 函数曲线的最远交点规定为透射电镜的信息分辨率。
若在两个点像的中央合成强度分布有26.5%的下陷，则我们说对应的两个 物点刚刚能被分辨。
相干光照明
用发自一点的单色光来照明标本，从标本上相邻两点发出的光是相干光。同上，把两物 点间隔为瑞利间格时，像的强度曲线绘制出来。当两物点（点光源）发出的光是相干光 时，在像平面上是振幅相加（干涉）而不是强度相加。两个像点中央的光强度没有凹陷， 反而高出原最大值的47%。
显微镜分辨率
按照几何光学定律, 只要适当选择物镜, 就可以把任意小的物体放 大到充分大,并能清晰地予以分辨。但是由于光的衍射现象的存在, 即使我们能把微小的物体放大到任意大, 清晰的程度却不能任意增 加, 只能得到一片模糊的光斑。衍射现象限制了显微镜对试样的清 晰观察。
衍射限制分辨率
理想情况，试样上一个发光点经透镜折射后, 在象平面上得到的应是一个几何点。光具 有波动性, 根据夫琅和费圆孔衍射试验得知, 一个物点经一个有限直径的透镜成象后, 在 象平面上得到的是一个以几何象点为中心、黑白相间的衍射圆环( 衍射象) , 直径为d的 中央亮斑集中了全部衍射象光能量的80 % 以上。
实践证明, 对此肉眼确实可在两个中央亮斑间看到有暗的间隔, 也就是说两 点的象是可分辨。
衍射效应对策
根据显微镜使用的具体情况，阿贝.指出物镜的最小分辨距离为：

扫描电子显微镜的分辨率测量及分辨率标样1.扫描电子显微镜的分辨率测量1.1扫描电镜的分辨率分辨率是形貌结构类放大仪器最重要的性能指标，它以能分辨的两点或两线间的最小间距为指标，分辨间距越小性能越好，分辨率越高。

它是光学显微镜和电子显微镜的最重要的指标。

对扫描电镜而言它首先决定于整个仪器的设计，诸如：电子透镜的最小球差设计、电子的色差降到最低、仪器固定象散的减少以及附加象散的消除等。

这一切取决于扫描电镜电子光学系统的设计、高压和透镜电源的稳定度指标、电子透镜极靴材料的磁性能、材料的均匀性及极靴的机械加工精度与加工过程中的无磁化处理等。

当一台仪器制造完成以后，这些决定扫描电镜的分辨率先天条件就决定了，它们成为了不可改变的固定条件。

所以我们说，仪器的先天条件就决定了扫描电镜的分辨率，规定了这台仪器所能达到的最优分辨率，实际使用中往往低于这个分辨率指标。

每一台扫描电镜在长期使用过程中它在每次观察物质结构的放大图象时，它的图象清晰度和实际分辨率可能时高时低，这一切又与仪器的调试对中状态、使用条件和环境等诸多因素有关。

这些因素有：(1)仪器电子光路尤其是物镜上下极靴孔以及物镜光栏的清洁程度高低有关，应该保证污染脏物导致的象散降到最低。

(2) 电子光学系统的合轴对中处于最佳状态，尽量减少轴外电子束成象,减少各种象差，尤其是球差，它与孔径角的三次方成正比。

(3) 电网电压稳定有利于电源稳定度，使包括色差在内的象差降到最低。

电网的电压波动过大，还会造成杂散磁场影响扫描电镜透镜聚焦场的稳定性从而影响分辨率，所以应该避开用电高峰，不在电网电压波动过大时拍摄分辨率照片。

(4) 避免外界强烈的机械震动，可能造成样品台和样品的微扰动而使分辨率下降，尤其是临街并有大型货车通过，或有其它强烈震动源将对分辨率造成影响。

(5) 用一个大小合适而又清洁的新的物镜光栏对获得扫描电镜的最优分辨率有好处。

只有在上述诸多方面得到满足时，才有可能发挥出扫描电镜固有的最优分辨率，得到一张好的分辨率照片。

光学显微镜科普知识点
1.分辨率：分辨率是显微镜图像中最小可分辨的两个点之间的距离。

分辨率越高，显微镜能够显示的物体细节就越细致。

2.放大倍数：放大倍数是指物体在显微镜中被放大的倍数。

不同的目
镜和物镜组合可以获得不同的放大倍数。

3.物镜：物镜是显微镜中最重要的组成部分之一。

它们被设计成在不
同的焦距下放大样本，同时也决定了显微镜的分辨率和放大倍数。

4.目镜：目镜是显微镜中第二个重要的组成部分。

它们通常被设计成
具有低放大倍数和协同物镜放大倍数的功能，以提供清晰的图像。

5.对比度增强：通过增加样本的对比度使其在显微镜中更容易观察。

常见的对比度增强方法包括染色、蘸气、偏光等。

6.照明系统：显微镜中的照明系统是通过提供光源来照亮样品。

使用
不同强度和方向的光可以改变样品在显微镜中的外观和特性。

7.操作技巧：显微镜的正确使用和维护是获得清晰和正确图像的关键。

操作技巧包括正确对焦、正确选择放大倍数、调整照明和避免反射等。

光学显微技术的成像质量和分辨率是现代生物医学研究和实践中不可或缺的部分。

在最近几十年，随着现代科技和生物医学技术的不断革新，人们对于成像质量和分辨率的要求也越来越高。

在这篇文章中，我们将会从多个方面展开讨论。

首先，成像质量是光学显微技术的一个核心指标。

它直接反映了显微镜成像过程中所获取到的图像的质量。

因此，越高的成像质量意味着越清晰、更有利于细胞结构和功能研究的成像结果。

于此同时，分辨率也是影响成像质量的一个重要因素。

分辨率指的是显微镜系统内部分辨物体的细小程度的能力，也就是所能分辨两个很小物体之间的最短距离。

分辨率高意味着有更高的能力处理细微结构的能力，因此与成像质量存在着密切的联系。

目前，用于生物医学研究的光学显微技术主要包括了荧光显微镜、共聚焦显微镜、双光子激发显微镜等。

荧光显微镜是较为简单的一种光学显微技术，通过荧光染色样品后使用荧光显微镜来观察样品。

但荧光显微镜的分辨率和深度都存在一定的局限性，因此逐渐被共聚焦显微镜和双光子激发显微镜所取代。

这两者一般能够达到更高的分辨率和深度，更适合用于细胞生物学研究和神经科学。

其中共聚焦显微镜是通过联同激光、探头和传感器等多种技术特点，摆脱了荧光显微镜的局限性，可以快速地获得高质量的三维图像，并且非常适合成像活细胞、观察神经元等。

而双光子激发显微镜则在保持荧光显微镜便捷性与共聚焦显微镜分辨率、深度优势的基础上，增加了其所特有的深度成像和较小的光伤害等优势。

除此之外，成像质量和分辨率还可以通过不同的荧光染色方式、样品制备和组织标本超微切割方法来调整。

例如，在组织制备时可以通过改变渗透、包埋和冷冻等处理手段来优化分辨率。

此外，通过成像过程中的多重对焦和对齐策略，也可以在不影响成像结果的情况下优化成像质量和分辨率。

最后值得注意的是，尽管生物医学领域越来越重视清晰度和分辨率，但是在实际使用中，我们需要平衡成像通量、曝光时间和成像深度等因素的关系，而且成像过程中的光损伤和标本褪色也需要注意。

光学仪器分辨率的解释以及分析2015级生命科学方向薛峣515080910024众所周知，光学仪器的分辨率决定了其显示的物体的清晰程度。

然而，对于不同的光学仪器，其分辨率的物理意义是不同的。

更进一步，由于到最后的接收系统的是眼睛，因此若不考虑眼睛本身的分辨极限，好的分辨率也可能是无效的。

本文中，先对眼睛这一光学成像系统进行分析；再阐释某些典型光学仪器的分辨率的物理意义；最后再挑选一些例子进行计算，决定其分辨率是否有效。

一．眼睛的成像：眼睛的结构如果把眼睛类比于光学仪器，那么有这么几个眼睛的部分对应于光学仪器中的结构：1.瞳孔——光阑：瞳孔决定了眼睛能看到的视场以及进光量，以及更重要地，艾里斑的大小。

然而，由于人的头部和眼球是可以随意转动的，所以瞳孔的存在仅仅是调节进光量。

我们也可以因此认为，人的视场是任意大的。

2.晶状体——透镜：晶状体中包含了折射率不均匀的液体。

而眼镜和普通透镜最不一样的地方，在于它是可以调焦的。

调焦是由肌肉压缩晶状体来改变其曲率半径来实现的。

然而，眼睛能够调焦的范围是有限的。

正常人的眼睛物方焦距范围为(17.1-14.2)mm，像方焦距范围为(22.8-18.9)mm。

然而，由于眼睛肌肉紧张（像方焦距变小）时，人容易感到疲劳，因此我们人为地将明视距离定为25cm，即眼睛聚焦于25cm处的物体时，眼睛最为放松。

当然，人的聚焦范围并没有这么小。

出生的婴儿，其能够聚焦的最短距离是10cm。

在以后计算时，我们将适当引用这个聚焦距离。

3.视网膜——光屏：本来视网膜上有高分辨率的区域只有一个称之为黄斑的地方，即靠近光轴的一小块地方，但由于人可以任意转动其头部及眼球，这件事并不妨碍。

由于瞳孔以及晶状体有有限的大小，所以成像时不可避免地会发生衍射。

菲涅耳衍射的条件是物点到孔径距离与孔径大小可以相比拟。

但是对于眼睛来说，若取聚焦距离为10cm，取瞳孔最大直径为8mm，那么也只有8%的大小。

因此，我们认为可以近似为夫琅禾费圆孔衍射。

奥林巴斯显微镜物镜的数值孔径和分辨率显微镜物镜的数值孔径是其聚集的光，并在一个固定的物体距离解决细标本细节能力的量度。

图像形成光波穿过试样和如图1所示的该锥形光的纵切片示出孔径角，是由物镜的焦距确定的值中的倒置锥体进入物镜。

角μ是二分之一的孔径角（A）和涉及通过以下公式的数值孔径：数值孔径（NA）= n(sin μ)其中n是物镜的前透镜和样品盖玻璃，即从1.00范围为空气至1.51专门浸没油一个值之间的成像介质的折射率。

许多作者用变量α为μ数值孔径公式所示。

从这个方程很明显，当成像介质为空气（具有折射率，n = 1.0），则数值孔径仅取决于角度μ的最大值为90°。

角μ的sin，因此，具有（使用“干”显微镜物镜）的1.0（sin（90°）= 1），这是用空气作为成像介质操作透镜的理论最大数值孔径的最大值。

在实践中，但是，它是很难达到0.95以上的数值孔径值与干物镜。

图2示出了一系列从变焦距和数值孔径的物镜导出的光锥。

作为锥改变光的角度为7°μ增加，如图2（a）至图2的（c）60°，在数值孔径从0.12至0.87所得的增加，接近限制时空气是成像中。

通过检查数值孔径方程，很明显，折射率是在实现数值孔径大于1.0的限制因素。

因此，为了获得更高的工作数值孔径，物镜的前透镜和试样之间的介质的折射率必须增加。

显微镜物镜现在可以允许成像另类媒介，例如水（折射率= 1.33），甘油（折射率= 1.47），和浸油（折射率= 1.51）。

护理应符合这些物镜被用于防止当一个物镜是用比它的物镜是为不同的液浸介质中使用，这将产生不希望的伪影。

我们建议显微镜从不使用专为浸油或者用甘油或水的物镜，虽然有几个新的物镜，最近出台了将与多个媒体合作。

你应该向制造商咨询是否有任何怀疑。

在60X和100X（或更高倍率）的放大倍率范围最物镜是设计用于浸油的使用。

通过检查上面的数值孔径方程，我们发现，与浸油得到的最高理论数值孔径为1.51（当sin（μ）= 1）。

简介荧光显微镜中的分辨率定义为样品上两点之间仍可区分的最短距离。

这主要由两个因素决定；显微镜分辨率，即显微镜可以分辨的最小物体，以及相机分辨率，即相机检测显微镜可以分辨的物体的能力。

显微镜的最大分辨率是物镜数值孔径和样品发射波长的函数，而相机分辨率完全由像素大小决定。

然而，荧光显微镜的分辨率最终受到光的衍射极限的限制，例如，当使用绿光(510 nm) 时，该极限约为220 nm。

这为可以解决的问题设定了下限。

因此，标准荧光显微镜中的常见做法是使用能够达到此下限的显微镜设置来检测最小的可分辨物体。

使用传统显微镜无法尝试比这更低的分辨率，只有使用超分辨率技术才能打破光的衍射极限。

显微镜分辨率光以波的形式传播，因此当它用透镜聚焦到一个小点时，无论物镜有多好，焦点的尺寸都会比实际的荧光团大。

图1：在物镜孔径边缘发生衍射的荧光发射器的衍射图案。

最终的衍射极限点在x 和y 方向可能是200-300 nm，在z 方向可能是500-800 nm。

这是因为荧光发射的波前（wavefront）在物镜孔径的边缘发生衍射。

这有效地将波前传播出去，将荧光发射加宽为中心点大于原始荧光团的衍射图案（图1）。

衍射极限光斑的大小大约是发射光波长大小的一半，但由Ernst Abbe 在1873 年确定的完整方程为：d = d / 2NA其中d 是衍射极限光斑的大小，λ是所用光的波长，2NA 是物镜数值孔径的 2 倍。

对于GFP 发射波长为~510 nm 和高数值孔径(NA 1.4)物镜的情况，显微镜解析的荧光团的大小为182 nm。

这比实际的荧光团大得多，实际荧光团可能只有 2 nm。

艾里斑衍射极限光斑呈艾里斑的形状（图2），以George Biddell Airy 的名字命名。

它由一个明亮的中心点和一系列围绕它的衍射环组成。

中心光斑的大小由发射光的波长和物镜的数值孔径决定。

图2 突出显示了增加物镜的数值孔径如何减小艾里斑的尺寸，从而增加可分辨细节的数量。

扫描电子显微镜的分辨率测量及分辨率标样1.扫描电子显微镜的分辨率测量1.1扫描电镜的分辨率分辨率是形貌结构类放大仪器最重要的性能指标，它以能分辨的两点或两线间的最小间距为指标，分辨间距越小性能越好，分辨率越高。

它是光学显微镜和电子显微镜的最重要的指标。

对扫描电镜而言它首先决定于整个仪器的设计，诸如：电子透镜的最小球差设计、电子的色差降到最低、仪器固定象散的减少以及附加象散的消除等。

这一切取决于扫描电镜电子光学系统的设计、高压和透镜电源的稳定度指标、电子透镜极靴材料的磁性能、材料的均匀性及极靴的机械加工精度与加工过程中的无磁化处理等。

当一台仪器制造完成以后，这些决定扫描电镜的分辨率先天条件就决定了，它们成为了不可改变的固定条件。

所以我们说，仪器的先天条件就决定了扫描电镜的分辨率，规定了这台仪器所能达到的最优分辨率，实际使用中往往低于这个分辨率指标。

每一台扫描电镜在长期使用过程中它在每次观察物质结构的放大图象时，它的图象清晰度和实际分辨率可能时高时低，这一切又与仪器的调试对中状态、使用条件和环境等诸多因素有关。

这些因素有：(1)仪器电子光路尤其是物镜上下极靴孔以及物镜光栏的清洁程度高低有关，应该保证污染脏物导致的象散降到最低。

(2) 电子光学系统的合轴对中处于最佳状态，尽量减少轴外电子束成象,减少各种象差，尤其是球差，它与孔径角的三次方成正比。

(3) 电网电压稳定有利于电源稳定度，使包括色差在内的象差降到最低。

电网的电压波动过大，还会造成杂散磁场影响扫描电镜透镜聚焦场的稳定性从而影响分辨率，所以应该避开用电高峰，不在电网电压波动过大时拍摄分辨率照片。

(4) 避免外界强烈的机械震动，可能造成样品台和样品的微扰动而使分辨率下降，尤其是临街并有大型货车通过，或有其它强烈震动源将对分辨率造成影响。

(5) 用一个大小合适而又清洁的新的物镜光栏对获得扫描电镜的最优分辨率有好处。

只有在上述诸多方面得到满足时，才有可能发挥出扫描电镜固有的最优分辨率，得到一张好的分辨率照片。