生物化学实验报告
题目：蛋白质浓度测定（微量凯氏定氮法）
姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科3班
同组者：张刚刚时间：2011/5/28
一、【实验目的】
1. 掌握凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量的原理和方法
2. 学会使用凯氏定氮仪
二、【实验原理】
凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH+3H2SO4 =2C02+3SO2+4H2O+NH3（1）
2NH3 +H2SO4 = (NH4)2SO4 （2）
(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3 （3）
反应（1），（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏烧瓶中进行（图1）。蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14％~18％，平均为16％）。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。
三、【试验器材】
1. 卵清蛋白
2. 凯氏定氮仪
3. 电炉
4. 消化架
5. 锥形瓶100ml（×5）
6. 量筒10ml(×1)
7. 滴定管（5ml，可读至0.02ml）
8. 凯氏烧瓶（×2）
9. 玻璃珠
10. 吸耳球
11．移液管（2ml，5ml，10ml×1）
四、【实验试剂】
1. 卵清蛋白溶液：2g卵清蛋白溶于0.9％NaCl溶液并稀释至100ml。如有不溶物，离心取上清液备用。
2. 浓硫酸（A.R.）
3. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾3份与硫酸铜1份混合研磨成粉末。
4. 30%氢氧化钠溶液：30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。
5. 2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml。
6. 混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:1混合。
7. 0.00963mol/L标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释标定。
五、【实验操作】
1．样品的消化
将两个50mL的凯氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0mL 蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入1.0mL样液（卵清蛋白液）。然后用取样器各加浓硫酸4mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾－硫酸铜混合物约200mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到凯氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，注意先启动抽风机在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。消化时间为2～3h，冷却，准备蒸馏。在消化时可以同时进行第二步。
2．定氮仪的洗涤
凯氏微量定氮蒸馏装置
1.电炉
2.蒸汽发生烧瓶
3.玻璃管
4.橡皮管6.反应室7.玻璃杯
8.气水分离器9.冷凝管10.锥形瓶11.棒状玻璃塞12.废液排出管
仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。
蒸气发生器中装加有H2SO4的蒸馏水和数粒沸石，加甲基橙指示剂后显粉红色。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受锥形瓶瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤5分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏3分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。若硼酸的颜色变为淡绿色，说明定氮仪内有残留氨，需要进一步用蒸汽洗涤。若反应室内有上次操作剩余的残夜，可以通过图1中7向反应式加冷的蒸馏水，然后短时间关闭4，则残夜会倒吸回贮液管，重复几次，并用蒸汽洗涤几分钟，再用上述方法检验是否已经洗干净。打开12废液排出管的夹子可以将废液放出。
3．标准品练习（标准硫酸铵溶液，含氮量0.3mg/ml）
仪器洗好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下11（图1）棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml硫酸铵溶液，然后将玻璃塞放回，向7（图1）玻璃杯中加入
10ml30%NaOH溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中，并留少量液体作水封。等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。立即用标准盐酸溶液进行滴定，如果用滴定结果计算出的标准硫酸铵中氮含量接近于0.3mg/ml。则说明整个实验操作正确，可以进行下一步。
4．样品测定
仪器洗好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下11棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml消化好的样品溶液，然后将玻璃塞放回，向7玻璃杯中加入10ml30%NaOH 溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中，并留少量液体作水封。等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。立即用标准盐酸溶液进行滴定，按上述方法洗涤仪器准备下一次蒸馏。重复蒸馏并滴定三次。
将2ml消化好的样品溶液改为2ml消化后的空白对照溶液，其他操作同上，测量三组。三组空白测量中，若锥形瓶中的硼酸溶液不变色，则无需滴定。
六、【注意事项】
1．凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。
2．普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。
3．定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。
4．消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡
