绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达

张历涵2013141241098

彭千2013141241068

一、质粒转化入感受态细胞并培养

1、原理

实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

2、实验步骤

2.1 DH-5a和BL・21感受态细胞的制备

(1) 将0~4 C保存的DH-5a和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 C下250 r/min过夜培养16 h °

(2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，

37 C活化培养2〜3 h至OD=0.3〜0.5。

(3) 取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min,然后于4 °C下5000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCI2缓和悬菌。冰上放置

15-30 min 后，4 C 下5000 r/min 离心10 min。

(4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCI2(含15%甘油)缓和悬菌，放在一20 C冰箱内保存。

2.2感受态细胞的转化

(1) 取制备好的感受态细胞100卩I,冰上解冻，均匀悬浮。

(2) 加入2卩丨酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。

(3) 42 C水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。

(4) 加入200卩丨LB液体培养基，37C, 50-100 rpm振荡培养1h。

(5) 取200卩I悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀

涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 C培养倒置12-16 ho

二、质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测

1、原理：

首先选择好将绿色荧光蛋白导入大肠杆菌的载体，一般选用pET-28a质粒，因为该质粒具有多酶切割位点，并且导入外源基因后可以充分表达。已知PEGFP-N3 质粒上携带表达绿色荧光蛋白的基因，此基因作为目的基因pET-28a质粒作为载体进

行重组前需要先提取并检测。

使用碱裂解法提取质粒，用到3种溶液，溶液I ： 50 mM葡萄糖、25 mM Tris・CI、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II : 0.2 N NaOH、1% SDS;溶液III : 3M 醋酸钾、2 M醋酸。选用适当浓度和适当pH值的Tris-CI溶液来调节溶液pho加入的

是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会

降低抽提得率。溶液 II

中NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，会使细胞膜从双层膜向微囊结构的相变化， SDS 为下一步做铺垫。溶液L1I 的作用SDS 在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS 能与 蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，所以沉淀也将溶液中 的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了 SDS 中的Na+而形成了不溶性的 PDS ，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA 很长，容易被PDS 共沉 淀。2 M 的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA 。基因 组DNA 一旦发生断裂，小于100 kb 的片断，就不容易与PDS 共沉淀。所以碱处理的时间 要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA 污染。这 一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使 PDS 沉淀更充分。

衽pH 为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负 电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子 筛作用下，事分子大小和构象不同的核酸分子涌动率出现较大的差异， 从 而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如漠化乙锭)后， 在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。在质粒提取的过程中，由于操作原因，提 取的质粒可能有三种：线性DNA 、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。当 提取的质粒 DNA 电泳时，同一质粒DNA 泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。2、实验步骤 2.1将目的基因质粒的大菌种接种衽液体培养基中(相应浓度抗生素) ，37C 培 养过夜。

2.2收集菌体

将扩增的菌体收集1.5mlEP 管中。每次4C, 12000r/min 离心2min ，弃上清液后 重 复一次，弃上清液。

2.3裂解菌体

(1) 将菌体沉淀重悬于100卩丨用冰预冷的溶液I 中，剧烈振荡10min.

(2)

加200卩I 新配制 的溶液U,盖紧管口，快速颠倒离心管

5次，以混合内溶 物5不可强烈振荡，放置冰上5min 左右。

(3) 加150 卩I 用冰预冷的溶液川，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡 10s ，使 溶液川在粘稠的细菌裂解物分散均匀，置冰上 15mino

(4) 4C 、10000r/min 离心5min ，将上清液转移到另一离心管中，并定量上清液的 体积。

24提取质粒DNA

(1) 加等体积酚：氯仿(1： 1)，于上清夜中'振荡混合'4C 、10000r/min ，离心 10min ，将上清液转移到另一离心管中，冰定量上清液的体积。

(2) 加2倍体积的无水乙醇和0.1体积的3mol/L NaAc ，室温下沉淀质粒DNA ，振 葡萄糖可以使悬浮后的菌不会快速沉积到管子底部。 EDTA DNase 的活性和微生物生