热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验

重大突破！治疗肝癌新可能，抑癌分子新发现—蛋白激酶PKCλi一、肝癌和基因突变有关肝癌目前仍是世界范围内最能对人类健康构成威胁的一种恶性肿瘤。

由于其主要诱因是HBV等肝炎病毒的慢性感染，因此，很多人每天都在惊惧中度过。

肝癌具有早期发现难、恶性程度高以及术后复发率高、5年生存率低等令人闻风丧胆的特征，因此很多乙肝战友谈虎色变。

除了HBV等肝炎病毒的慢性感染，非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪肝、黄曲霉素的摄入等都是肝癌的危险因素。

然而，很多人不知道的是，肝癌的起源其实跟我们自身的一些基因突变有关。

如果这些基因突变确定了，科学家们根据突变基因的特征设计治疗方案，也是肝癌治疗的思路之一。

二、抑癌蛋白分子PKC λ/i今年来自美国国家癌症研究所的Jorge教授发现了一种蛋白激酶PKC λ/i，并证明该种分子可以作为肿瘤抑制因子阻碍肿瘤的生长和扩散。

该分子已被证明在结肠癌中起抑癌作用。

氧化应激在肝组织损伤和肝细胞癌（HCC）的发生和发展中起着重要作用。

然而，在活性氧（ROS）生成过程中调节自噬和代谢重编程的机制，以及活性氧如何促进肿瘤发生，仍需充分了解。

该文发现肝细胞中蛋白激酶C（PKC）λ/ι的丢失促进了自噬和氧化磷酸化。

这导致活性氧的产生，通过NRF2通过细胞自主和非自主机制驱动该细胞癌。

尽管PKCλ/ι在癌基因驱动的癌症模型中促进肿瘤发生，但新的证据表明，它在更复杂的致癌过程中是一种肿瘤抑制因子。

一直以来，PKCλ/ι水平与HCC的组织学肿瘤分级呈负相关，证明这种激酶在肝癌中是一种肿瘤抑制因子。

为了获得能量，肝癌细胞需要消耗葡萄糖和脂肪，这2个过程导致了一种名为“NRF2蛋白”的激活，这种蛋白可以驱动肿瘤的生长。

研究人员发现，PKCλ/ι可以阻碍上述的代谢过程，从而使肿瘤组织变得更没有侵略性。

研究人员通过观察肝癌小鼠模型以及人类肝癌样本确定了上述猜想。

即PKCλ/ι在非肿瘤组织中的低表达与肿瘤组织侵袭性降低有关。

2024年高考生物复习专题题型归纳解析—情境信息类情境信息类题是生物学考试中的热门题型,《中国高考评价体系》中提到,考生应当能够客观全面地获取可相关信息,能够从情境中提取有效信息。

获取信息的能力主要包括:(1)从提供的材料中获取相关的生物学信息、加工处理信息、转换信息、交流信息的能力;(2)关注对科学、技术和社会发展有重大影响的、与生命科学相关的突出成就及热点问题。

情境信息类题目主要包括:文字信息类、曲线图信息类、柱形图信息类、表格信息类和过程模式图信息类。

这些题目往往具有一定的难度，做这类题时重点是提取新信息，将其与教材的知识进行结合、转化、分析。

其特点可概括为“新情境、旧知识”。

所以这种题型往往是高起点、低落点。

【题型1】文字信息类【典例分析1】（2023·河北·统考高考真题）拟南芥发育早期的叶肉细胞中，未成熟叶绿体发育所需ATP须借助其膜上的转运蛋白H由细胞质基质进入。

发育到一定阶段，叶肉细胞H基因表达量下降，细胞质基质ATP向成熟叶绿体转运受阻。

回答下列问题：(1)未成熟叶绿体发育所需ATP主要在合成，经细胞质基质进入叶绿体。

(2)光照时，叶绿体类囊体膜上的色素捕获光能，将其转化为ATP和中的化学能，这些化学能经阶段释放并转化为糖类中的化学能。

(3)研究者通过转基因技术在叶绿体成熟的叶肉细胞中实现H基因过量表达，对转H基因和非转基因叶肉细胞进行黑暗处理，之后检测二者细胞质基质和叶绿体基质中ATP相对浓度，结果如图。

相对于非转基因细胞，转基因细胞的细胞质基质ATP浓度明显。

据此推测，H基因的过量表达造成细胞质基质ATP被（填“叶绿体”或“线粒体”）大量消耗，细胞有氧呼吸强度。

(4)综合上述分析，叶肉细胞通过下调阻止细胞质基质ATP进入成熟的叶绿体，从而防止线粒体，以保证光合产物可转运到其他细胞供能。

【答案】(1)线粒体（或“线粒体内膜”）(2) NADPH（或“还原型辅酶Ⅱ”）暗反应（或“卡尔文循环”）(3) 降低叶绿体升高(4) H基因表达（或“H蛋白数量”）过多消耗光合产物（或“有氧呼吸增强”）【分析】由题干可知，拟南芥发育早期的叶肉细胞中，未成熟叶绿体发育需要来自细胞质基质的ATP，ATP是细胞中的直接能源物质，主要细胞呼吸和光合作用产生，其中细胞呼吸产生的ATP可以用于各种生命活动，因此未成熟的叶绿体发育所需的ATP来自细胞呼吸，细胞有氧呼吸产生大量ATP，有氧呼吸的场所主要在线粒体，因此细胞线粒体产生大量ATP通过叶绿体膜上的H蛋白转运至叶绿体促进其发育。

专题02 光合作用与呼吸作用相关实验探究目录导航一、真题考法归纳考法01 借助细胞呼吸的影响因素考查科学思维考法02 借助细胞呼吸的原理与应用考查社会责任考法03 借助光合色素考查生命观念考法04 借助光合作用因素考查科学探究新考法借助光合作用和呼吸作用的关系考查社会责任二、常考热点实验梳理三、实验热点专练四、实验命题预测TTC法检测种子活力，TTC（无色）进入活细胞后可被[H]还原成TTF（红色）。

大豆充分吸胀后，取种胚浸于0.5%TTC溶液中，30℃保温一段时间后部分种胚出现红色。

下列叙述正确的是（）A．该反应需要在光下进行B．TTF可在细胞质基质中生成C．TTF生成量与保温时间无关D．不能用红色深浅判断种子活力高低2．（2021·湖南·统考高考真题）下列有关细胞呼吸原理应用的叙述，错误的是（）A．南方稻区早稻浸种后催芽过程中，常用40℃左右温水淋种并时常翻种，可以为种子的呼吸作用提供水分、适宜的温度和氧气B．农作物种子入库贮藏时，在无氧和低温条件下呼吸速率降低，贮藏寿命显著延长C．油料作物种子播种时宜浅播，原因是萌发时呼吸作用需要大量氧气下列叙述错误的是（）A．干制降低食品的含水量，使微生物不易生长和繁殖，食品保存时间延长B．腌制通过添加食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖C．低温保存可抑制微生物的生命活动，温度越低对食品保存越有利D．高温处理可杀死食品中绝大部分微生物，并可破坏食品中的酶类4．（2022·浙江·高考真题）下列关于细胞呼吸的叙述，错误的是（）A．人体剧烈运动会导致骨骼肌细胞产生较多的乳酸B．制作酸奶过程中乳酸菌可产生大量的丙酮酸和CO2C．梨果肉细胞厌氧呼吸释放的能量一部分用于合成ATPD．酵母菌的乙醇发酵过程中通入O2会影响乙醇的生成量5．（2021·湖北·统考高考真题）采摘后的梨常温下易软化。

果肉中的酚氧化酶与底物接触发生氧化反应，逐渐褐变。

大鼠蛋白激酶C（PKC）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，组织及相关液体样本中蛋白激酶C（PKC）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠蛋白激酶C（PKC）水平。

用纯化的大鼠蛋白激酶C（PKC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入蛋白激酶C（PKC），再与HRP标记的PKC抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的蛋白激酶C（PKC）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠蛋白激酶C（PKC）浓度。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。

大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中P-PKC含量。

实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗P-PKC抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗P-PKC抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的P-PKC呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板：一块（96孔）2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 U/L，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，1.56 U/L，样品稀释液直接作为标准浓度0 U/L，临用前15分钟内配制。

如配制50 U/L标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）100 U/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液：1×20ml。

4. 检测稀释液A：1×10ml。

5. 检测稀释液B：1×10ml。

6. 检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。

一、实验目的本实验旨在通过磷酸肌酸底物法测定肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）的活性，并探讨其在生物体内的功能。

通过实验，了解CK活性受温度、pH值等因素的影响，以及酶的激活和抑制现象。

二、实验原理肌酸激酶（CK）是一种广泛存在于生物体内的重要酶，参与细胞内能量代谢过程。

磷酸肌酸底物法是一种常用的测定CK活性的方法。

该法基于CK催化磷酸肌酸（Creatine Phosphate，CP）与ADP反应生成ATP和肌酸（Creatine，Cr）的原理。

在特定条件下，ATP的生成量与CK的活性成正比。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 肌酸激酶样品- 磷酸肌酸（CP）- ADP- NADH- 磷酸氢二钠（NaH2PO4）- 磷酸二氢钠（Na2HPO4）- 氯化镁（MgCl2）- 氯化钠（NaCl）- 碘化钾（KI）- 碘液- 水浴锅- 移液器- 试管- 离心机2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 量筒- 胶头滴管- 恒温箱四、实验方法与步骤1. 配制底物溶液：- 称取一定量的CP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。

- 称取一定量的ADP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。

- 将NADH用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。

2. 配制反应混合液：- 取若干试管，分别加入不同浓度的肌酸激酶样品、磷酸肌酸溶液、ADP溶液、NADH溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、氯化镁溶液和氯化钠溶液。

- 将混合液置于水浴锅中，调节温度至实验设定的温度。

3. 测定酶活性：- 在特定时间点，向反应混合液中加入碘液，观察溶液颜色的变化。

- 用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度值。

- 根据吸光度值计算酶活性。

4. 稳定酶活性：- 在实验过程中，分别调节pH值和温度，观察酶活性的变化。

五、实验结果与分析1. 酶活性与温度的关系：- 实验结果表明，随着温度的升高，CK的活性逐渐增加，但当温度超过一定范围时，酶活性开始下降。

高考生物热点情境80周期蛋白依赖性蛋白激酶一、选择题1．(2022·天津南开中学高三月考)CDK蛋白是一类调控细胞周期进程的激酶。

P27蛋白可以插入到CDK蛋白中改变其构象，使细胞周期停滞于DNA复制前。

研究发现，敲除小鼠的P27基因，基因敲除小鼠的体型和一些器官的体积均大于正常小鼠。

以下推论不正确的是()A．CDK蛋白可激活细胞有丝分裂B．P27蛋白是CDK蛋白的活化因子C．敲除P27基因可能引发细胞癌变D．P27基因表达能抑制细胞的增殖答案 B2．研究表明，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)是细胞周期调控的核心物质，各种CDK在细胞周期内特定的时间被激活，驱使细胞完成细胞周期。

其中CDK1(CDK 的一种)在分裂间期活性高，分裂期活性迅速下降，以顺利完成分裂。

下列说法正确的是()A．幼年个体体内CDK含量较高，成年后体内无CDKB．温度的变化不会影响一个细胞周期持续时间的长短C．CDK1可能与细胞分裂过程中纺锤丝的形成有关D．CDK1可干扰细胞周期，在癌症治疗方面有一定的积极作用答案 C解析由题意可知，细胞周期依赖性蛋白激酶是细胞周期调控的核心物质，不管是幼年个体还是老年个体内都会进行细胞的分裂，A错误；酶的活性是受温度影响的，所以温度的变化会影响一个细胞周期持续时间的长短，B错误；各种CDK 在细胞周期内特定的时间被激活，驱使细胞完成细胞周期，故能促进癌细胞分裂间期的某些活动，促进癌细胞的增殖，D错误。

3．细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(简称CDK)对细胞周期起着核心性调控作用，不同种类的CDK沿细胞周期时相交替活化：活化的CDK1启动细胞向分裂期推进，活化的CDK2可促使细胞进入S期(DNA合成期)。

癌细胞中的某个基因突变后可诱导激活CDK抑制因子，造成细胞周期停滞，引发细胞衰老。

下列叙述错误的是()A．活化的CDK1可能会促进染色质凝缩、核膜解体B．CDK2的活性进入分裂期后可能会下降C．控制CDK抑制因子合成的基因可能属于原癌基因D．研发CDK抑制剂药物可能为癌症的治疗提供思路答案 C解析细胞内激活的CDK抑制因子具有抑制细胞增殖、促进细胞衰老的作用，因此控制CDK 抑制因子合成的基因属于抑癌基因，C错误。

丙酮酸激酶活性测定实验报告
原理：在二磷酸腺苷（ADP）存在的条件下丙酮酸激酶（PK）催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化成丙酮酸，在辅酶Ⅰ还原型（NADH）存在情况下，丙酮酸被LDH转化为乳酸，若标记荧光于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD。

参考值：正常荧光在20min内消失。

（15.0±1.99）U/gHb（37℃）（ICSH推荐Blume法）。

临床意义：PK严重缺乏者荧光60min不消失；PK中间缺乏时荧光25～60min消失。

纯合子PK值在正常活性到25%以下，杂合子为正常25%～50%。

丙酮酸激酶是糖酵解途径中的一个关键酶，能催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为烯醇式丙酮酸，并产生ATP，所以具有重要的生理作用。

丙酮酸激酶在人体分布广泛，有四种同工酶，分为L、R、M1和M2。

L型仅存在于肝实质、肾脏及小肠黏膜中，R型仅存在于成熟红细胞中，M1型存在于大脑及肌肉中，M2型除骨骼肌外，广泛分布于各种组织中，特别是肾脏与恶性肿瘤细胞中含量较高。

在正常成人肝脏主要是L型，而在胎儿则主要为R型。