质粒的转化

常见的转化法
（一） CaCl2法（大肠杆菌的转化） （二）电转化法 （三）农杆菌Boletus介导转化（比较少见）

质粒转化大肠杆菌

本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理， 制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋 质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒， 产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与 这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表 面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质 粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体 内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使 细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因， 提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应 抗生素培养皿中传代，形成菌落
实验步骤



一实验器材 天平，称量匙，加热磁力搅拌器、搅拌子 可调移液器P1000、P200、P20及 其经消毒的盒装蓝、黄吸头 经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架 定时器、记号笔、一 次性手套和筒纸 42℃恒温水浴 4℃和-70℃冰箱 煤气灯或酒精灯 ，恒温培养 摇床（调至37℃，225rpm） ，37℃培养箱 玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头 部在煤气灯上烧成“L”形）， 消毒过的洁净培养皿（直径10cm） 二．试剂 LB培养基 细菌培养用胰化蛋白胨 10g 细菌培养用酵母提取 物 5g NaCl 5g 加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用 5M NaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2 （1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml） 500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光 处。 含有琼脂的培养基 ，即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼 脂。 抗生素琼脂平板 待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿， 约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记， 封于塑料袋中，倒臵，于4℃冰箱内避光保存。 pH试纸（或pH计）
质粒转化大肠杆菌的新方 涂布平板筛选转化重组子。 法将受体细胞感受态的诱导建 立、质粒DNA转化及转化子的 筛选等步骤合并在Ca2+选择平 板上一步完成，在传统的转化 方法中转化过程的变温处理被 认为对转化率的提高具有着重 要意义。我们受体菌和转化 DNA混合后涂布到事先预冷的 平板上比使用未经预冷的平板 能得到更高的转化效率，但两 者间的差异不超过一个数量级 （分别为1.8×105和3.0×104 转化子/Μg DNA）
CACL2诱导受体细胞使其成为"感受态"


CaCl2处理对于诱导大肠杆 菌受体细胞"感受态"的形成具 有重要作用,在传统的转化方法 中，CaCl2处理及转化都是在 液体条件下完成的 在一定的离子浓度范围内 CaCl2同样可以诱导涂布到平 板上的受体细胞建立感受态， 并进行质粒DNA的转化。采用 这种平板转化方法所得到的转 化子菌落较传统方法形成的转 化子菌落略小，说明培养基中 的CaCl2可能在一定程度上对 细菌的生长有抑制作用。
三．实验材料 来源于实验一的重组质粒 受感态大肠杆菌 碎冰及碎冰保温盛器 实验步骤 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。 吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 50 ul DNA5 ul 轻 轻混匀，静臵冰上30分钟。 于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中， 静臵2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1 小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒臵，存放于 37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否 实验结果 转化成功，培养皿中可见散在的菌落。 转化失败，培养皿上无菌落，或菌 落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效
质粒
转化是将外源DNA分子导入到受体细胞， 使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所 用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异 株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，M)。将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方 法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变， 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。 进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实 现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传 性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培 养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的 细胞)。 注：细菌细胞能摄入外来DNA的状态叫感 受态

与传统方法相比，具有操作简便易行的优点，整个转化过程仅需 2 min左右，无需其他特殊仪器及试剂，且转化率与传统方法基本相 当，足以满足Baidu Nhomakorabea般常规克隆的需要。同时，用平板转化代替液体转化， 对进一步揭示大肠杆菌的DNA转化机理也有一定的方法学上的意义
质粒的转化
1:质粒的认识 2：转化的定义 3：常用的转化法 4：举例实验 5：快速质粒转化与传统质粒转化的比较

世界上第一例转基因植物——烟草1983年在美国 问世。它是一种含有抗生素药类抗体的烟草
转基因豆


质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区 DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、 又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目 前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌 以及酵母菌等生物中，乃至于动植物的线粒体等胞器中。 天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。 质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以 同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数 （copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有 些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环 素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞 额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病 力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定 性的作用。它是基因工程最常见的运载体